内毒素急性肺损伤与中性粒细胞凋亡研究现状

朱珊珊（综述） 刘功俭（审校）

徐州医学院麻醉学院，江苏徐州 221000

细胞凋亡（apoptosis）又称为程序性细胞死亡（programmed cell death，PCD），是指为维持内环境稳定，由基因控制的细胞自主的有序的死亡。它涉及一系列基因的激活、表达以及调控，不伤及邻近细胞，保持组织结构稳定，并将炎症反应限制在最小范围的高级调节过程。国内外研究发现，一些细胞因子、蛋白酶类及黏附分子等能通过抑制炎症细胞凋亡，延长炎症反应时间，而参与急性肺损伤（acute lung injury，ALI）的炎症反应过程[1-2]。笔者复习近几年国内外相关文献，从PMN凋亡的角度对LPS急性肺损伤的发病机制作一综述。

1 中性粒细胞（PMN）凋亡与内毒素性ALI

PMN半衰期短，在外周血循环中存活8～20 h，而进入感染或发炎的组织内其存活时间可增加数倍。肺是PMN最容易聚集的器官，而肺组织中的PMN聚集发生于肺毛细血管床，此处PMN的含量是其他血管床的50 倍[3]。若无细胞因子炎症因子参与，老化的PMN会自发凋亡。与坏死不同，凋亡的PMN无细胞毒素释放到组织细胞周围。急性炎症时，PMN由于局部炎症介质的作用而发生凋亡延迟，凋亡延迟的PMN在炎症部位通过呼吸爆发产生大量自由基、蛋白水解酶及炎症介质等有害物质造成组织损伤，增加肺组织的炎症反应，从而导致ALI，降低存活率[4]。

2 PMN凋亡信号传导途径

2.1 核因子-κB（nuclear factor-kappa B，NF-κB）途径

NF-κB可通过介导多种炎症介质转录、表达和调控与凋亡相关的重要基因的表达来参与PMN凋亡的调控。内毒素刺激细胞后，核因子的抑制剂 IκB（inhibitor κB，IκB）发生磷酸化降解，NF-κB与IκB发生解离，NF-κB迅速从细胞质移位到细胞核，在核内与目的基因，如编码诱导型一氧化氮合成酶（induced-nitric oxide synthase iNOS）、肿瘤坏死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α） 的 κB 位点特异性结合，来促进相关基因的转录，调控TNF-α细胞因子、黏附分子和炎症相关的酶及蛋白质的表达。反过来，NF-κB调节产物，如TNF-α、细胞介素 1β（interleukin 1β，IL-1β）又能激活 NF-κB，形成一个能放大且延续炎症反应的复杂调节环路，导致全身炎症反应综合征（SIRS），诱发肺、肾及肝等多个脏器的损伤[5]。

NF-κB活化抑制PMN凋亡的机制可能为：①NF-κB活化促进促炎症细胞因子（IL-6、IL-8）和粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子（GM-CSF）表达，而抑制PMN凋亡；②NF-κB活化后可诱导细胞表达死亡受体-1（TNFR1）、结合因子（TFAF1、TFAF2）和凋亡抑制蛋白（IAP1、IAP2），抑制 Caspase 级联反应，阻断死亡受体TNFR1 和Fas介导的凋亡信号传导，抑制细胞凋亡；③NF-κB活化亦可能通过调控A1 等Bcl-2 家族抗凋亡蛋白的表达来抑制PMN凋亡[6]。通过以上叙述不难看出NF-κB的转移及活化是SIRS或ALI的关键环节之一。抑制NF-κB信号通路，可有效地抑制ALI中TNF-ɑ炎性因子的产生。若在ALI早期抑制NF-κB活化，可为防治ALI/ARDS提供新的靶点。

2.2 Fas-Fasl途径

Fas属于细胞表面受体家族，是一种Ⅰ型跨膜糖蛋白，相对分子质量为45 000，在白细胞、肺泡巨噬细胞及肺组织等多种细胞组织均有表达。Fasl为Fas的配体，是一种相对分子质量为40 000 的Ⅱ型膜蛋白，主要在活化的淋巴细胞和自然杀伤细胞中表达。Fas-Fasl结合后引起Fas抗原三聚体化，Fas胞内区的死亡结构域（DD）与胞质中已有的Fas相关死亡结构域 （fas associated death domian，FADD）C端的 DD结合，FADD再以N端的 DED（death effector domian）与Procaspase-8（或Procaspase-10）N端前区域内的DED结合形成死亡诱导信号复合体 （death inducing signal complex，DISC），Procaspase-8 发生裂解后活化，并使Caspases家族的一系列凋亡蛋白酶的激活，从而引发Fas蛋白所在的细胞凋亡。Caspase-8 激活下游的Caspases诱导的凋亡主要有两种信号通路[7-8]，第一条信号途径是在当DISC中Caspase-8 充足时，通过激活 Caspase-3、Caspase-6、Caspase-7，引起细胞裂解而凋亡。而当caspase-8 不足时，通过第二条信号途径，即Caspase-8 催化断裂Bcl-2 家族的促凋亡成员bid形成的裂解片段p15 移入线粒体，破坏线粒体膜的完整性，使细胞色素C释放，细胞色素C再与胞质中凋亡蛋白酶活化因子-1 结合，来激活Procaspase-9。Caspase-9 被活化，随之激活Caspase-3等酶系导致细胞凋亡。Nwakoby等[9-10]观察到PMN对Fas诱导的凋亡较敏感，在表达高水平Fas的同时也显著表达Fasl，在感染血清中Fasl的浓度与PMN凋亡率呈正相关，抗Fasl抗体能对抗感染血清诱导的PMN凋亡，活化型Fas抗体IgM可以显著加速PMN的自发性凋亡进程，而拮抗型Fas抗体IgG1则有凋亡抑制功能。激活的Caspase-3 通过蛋白水解来激活DNA酶，介导细胞染色体DNA碎裂和磷脂酰丝氨酸（phosphatidylserine，PS）移向膜外，启动细胞凋亡，因此，细胞中激活的Caspase-3 减少就意味者细胞凋亡的延迟。SIRS过程中过量释放的炎症因子如 TNF-α、γ-干扰素 （IFN-γ）、白细胞介素-8（IL-8）、脂多糖（LPS）等被证明可通过调控Fas等凋亡基因的表达抑制PMN的凋亡[11]。Fasl和TNFR1 的表达下调，Caspase-3、Caspase-6、Caspase-7、Caspase-8 的表达下调，游离出肺上皮内皮屏障的PMN中的Caspase-3、Caspase-8、Caspase-9 的活化受到抑制[12]，这些都导致PMN的寿命延长，造成肺组织中PMN超负荷而释放大量的炎性代谢产物，加重肺损伤。

3 PMN凋亡的调节

3.1 细胞因子

一般情况下，PMN在病原体消除后很快就会被机体清除， 但是某些炎性因子如 LPS、TNF-α、IL-8、IL-6、IL-1β、GM-CSF可抑制PMN的凋亡[13]。赵志勇等[14]对30例体外循环（CPB）心脏直视手术病例在不同的时间点抽取静脉血，测定PMN数量、PMN凋亡率、血浆白介素6（IL-6）、白介素8（IL-8）浓度，发现PMN凋亡率在CPB期间明显降低，与CPB时间呈负相关。PMN数量、IL-6、IL-8 血浆浓度在CPB期间明显升高，与其凋亡率呈负相关，与CPB时间呈正相关，认为CPB期间细胞因子IL-6、IL-8 释放增多导致PMN的凋亡延迟、PMN数量增加、生存周期延长，从而加剧炎症反应扩散和组织损伤。TNF-α被认为是引起ALI/ARDS的最重要的细胞因子之一，LPS刺激单核巨噬细胞后可释放大量的TNF-α，能直接损伤肺血管内皮细胞，并能动员、趋化、黏附、聚集、激活PMN，使肺内的PMN急剧增多，而且可增强 PMN的吞噬能力，促进PMN脱颗粒和释放溶酶体酶，增强PMN呼吸爆发，产生过多的氧自由基，它还可激活NF-κB介导其他细胞因子（如IL-1、IL-6、IL-8）的合成与释放，启动炎症级联反应[15]。

3.2 蛋白酶类

PMN中含有多种蛋白酶，其中弹性蛋白酶（neutrophil elastase，NE）与肺组织损伤关系最为密切，有实验已经证实，在LPS诱导大鼠急性肺损伤动物模型肺内，NE的表达量与活性明显增加[16]。炎症状态下，激活的PMN可释放NE，NE可消化肺组织结构中的弹性蛋白，分解细胞间的纤维连接蛋白，造成弹性纤维和胶原纤维断裂、分离，损伤血管内皮细胞和基底膜组织细胞，使富含蛋白质的液体进入到肺泡腔、肺间质导致肺水肿、肺不张；NE能损伤肺泡上皮细胞，破坏肺泡表面活性物质，使肺泡扩张[17]，还可裂解巨噬细胞表面的磷脂酰丝氨酸受体和CD14，特异性阻断巨噬细胞对凋亡细胞的识别，使气道内凋亡细胞清除不足，导致ALI的持续进展。另外金属蛋白酶（MMPS）也参与细胞外基质裂解，活化的PMN可释放大量的MMP-8 及MMP-9，其中MMP-9 的主要底物Ⅳ型胶原就是血管基底膜的主要成分。实验研究已经发现，抑制PMN弹性蛋白酶或基质金属蛋白酶的活性可以降低脓毒症所致动物ALI的发生率并改善呼吸功能[18-19]。曾在2003年作为非典治疗药物用于临床的特异性NE抑制剂——西维来司他 （Sivelestat），近年来通过动物实验及临床研究发现，该药可提高脓毒血症大鼠的生存率，减轻脓毒血症鼠的全身炎症反应，可改善ALI患者的肺功能，能缩短患者ALI持续时间、ICU停留时间及住院时间，有望成为治疗ALI的亮点药物[20-22]。

3.3 黏附分子

细胞黏附分子（cell adhesion molecule，CAM）是一类介导细胞与细胞、细胞与细胞外基质间相互结合的重要活性物质，它在维护正常组织的稳定、介导炎症细胞的迁移、血栓的形成以及肿瘤转移等过程中起重要的作用。国内曾涟等[23]采用盲肠结扎穿孔术复制脓毒症动物模型，以探讨脓毒症大鼠肺组织细胞间黏附分子-1（ICAM-1）的表达变化及其与急性肺损伤的关系，结果发现，脓毒症4 h后大鼠肺组织中ICAM-1 的表达水平升高，并持续升高至24 h，同时伴有支气管肺泡灌洗液白细胞计数、肺湿/干重比的增加和肺组织病理损害的加重。免疫印迹法测定ICAM-1 的表达与支气管肺泡灌洗液白细胞计数、肺湿/干重比呈正相关，认为脓毒症大鼠肺组织中ICAM-1 呈过度表达，并参与了脓毒症肺损伤过程[24-25]。组织炎症时，在黏附分子与细胞膜受体的相互介导下，PMN被激活导致β2整合素表达上调而L-选择素下降，不仅使穿过内皮向炎症区迁移的PMN活力增强，而且使细胞死亡的程序表达延迟，可能是整合素与配体结合，启动酪氨酸激酶及丝氨酸-苏氨酸依赖性激酶，使细胞内钙离子释放所致。

4 小结与展望

综上所述，PMN作为机体内最活跃的炎症细胞，可被LPS诱导激活并向损伤部位聚集，而产生炎症因子的瀑布式反应，导致ALI等炎性疾病恶化，而PMN的凋亡延迟会进一步加重肺损伤，适度清除PMN，抑制PMN的凋亡延迟是控制炎症发展的重要举措。深入研究PMN与ALI的关系，可为进一步揭示ALI的发病机制提供理论基础，为设计研发具有针对靶器官治疗的药物带来新的突破。

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