牛黄上清丸 (片、胶囊)挥发油特征图谱研究

吴 芳， 乔蓉霞， 杨瑞瑞， 王国海

(陕西省食品药品检验所，陕西西安710061)

牛黄上清丸 (片、胶囊)属于国家基本药物目录品种，具有清热泻火、散风止痛的功效。标准收载于《中国药典》2010年版一部，处方由十九味中药组成。其中牛黄上清丸由全粉入药;牛黄上清片由相同的处方组成，制剂工艺中连翘、薄荷、荆芥穗三味饮片提取挥发油［1］。牛黄上清胶囊也由相同处方组成，制剂工艺中连翘、薄荷、荆芥穗、当归、川芎、菊花、白芷七味饮片提取挥发油。

中药中有相当一部分饮片含有挥发油，挥发油是这些饮片发挥药理药效作用的重要因素，挥发油若与空气及光线经常接触会逐渐氧化变质，使挥发油颜色变深，失去原有香味，挥发油的气味往往是其品质优劣的重要标志［1］。另外，随着近年来很多制剂都在原有传统剂型的基础上，改变制剂工艺，增加新的剂型［2］，对部分饮片提取挥发油后加入制剂，但质量标准中对挥发油的检验检测项目缺失或不够完善。

为了有效控制制剂中挥发油的质量，以牛黄上清丸(片、胶囊)为例，进行了大量系统的试验，采用研究特征图谱的形式，对比分析了相同剂型的同一生产厂家、不同生产厂家及同品种系列不同剂型的样品之间的差异;初步建立了含挥发油制剂中挥发油检验检测的通用方法，特征图谱相似度表可以反映多批次样品间的差异大小。

1 仪器、试剂与材料

美国安捷伦公司6890N气相色谱仪，FID检测器;德国塞多利斯公司BS224S电子分析天平。连翘、荆芥穗、薄荷、当归、川芎、菊花饮片采购自市场，由本实验室鉴定后使用;α-蒎烯、胡薄荷酮、龙脑、异龙脑、樟脑对照品(批号分别为897-200001、111706-200602、110881-200706、1512-200201、747-200106)均采购自中国药品生物制品检定所;样品制剂均购自市场。

2 实验方法

2.1 样品溶液的制备 取牛黄上清丸4丸 (为一次服用量的4倍)，剪碎;牛黄上清片20片 (为一次服用量的5倍)，研细牛黄上清胶囊20粒 (为一次服用量的6.7倍)内容物，研细，置500 mL烧瓶中，加入100 mL水，连接挥发油提取器，自上端加入2 mL乙酸乙酯，连接冷凝管，加热提取1 h后，分取乙酸乙酯层，加乙酸乙酯定容至10 mL量瓶中，摇匀。

2.2 模拟处方样品溶液 牛黄上清丸按照处方量的十分之一量，取各饮片粉末 (共62.2 g)，加入炼蜜77.75 g(按照每100 g加入炼蜜125 g)，按照规格，制成23丸;牛黄上清片、胶囊按照各自处方及制法制备。均按照2.1项制备模拟处方样品溶液。

2.3 色谱条件 Agilent HP-5(30 m×320 μm，0.25 μm)色谱柱;FID检测器温度为250℃;进样口温度为200℃;柱温为起始温度80℃，保持2 min后，以5℃/min升至280℃，保持1 min;分流比为5∶1;柱流量0.6 mL/min。

2.4 精密度试验 取同一样品溶液连续进样6次，所得主要色谱峰数量相同，各峰保留时间RSD均小于0.01%。

2.5 重复性试验 取同一批样品6份分别制成供试品溶液，进样后得到的主要色谱峰峰数量相同，保留时间RSD均小于0.01%。

2.6 稳定性试验 取同一样品溶液在0、6、10、19 h进样，所得色谱峰峰数量相同，各峰保留时间RSD均小于0.01%。

3 峰归属

根据处方，取需要提取挥发油的饮片 (连翘、荆芥穗、薄荷、当归、川芎、菊花)适量，分别提取挥发油，用乙酸乙酯溶解，吸取与制剂中每味药材相当的进样量注入气相色谱，收集色谱图;分别称取各对照品适量加乙酸乙酯制成对照品溶液，吸取适量注入气相色谱，收集色谱图。根据峰保留时间的不同确认色谱峰进行归属［4-6］。

4 特征图谱的生成

4.1 丸剂特征图谱的生成

4.1.1 利用药典委员会“中药色谱特征图谱相似度评价系统A版”［3］软件对检测批次较多、市场份额大的某生产企业的11批样品色谱图和实验室按处方工艺自制的样品色谱图共同建立共有模式。结果表明，该厂生产的品种和按处方工艺自制的样品的色谱图相似度均大于0.99。将得到的特征图谱作为丸剂的特征图谱。生成的特征图谱有19个共有峰。根据峰归属的结果:1号峰为α-蒎烯 (连翘药材);4号峰为樟脑;5、6号峰为异龙脑、龙脑 (冰片药材);8号峰归为薄荷药材;10号峰为胡薄荷酮 (荆芥穗药材);13号峰归为白芷药材;14～19号峰归为川芎、当归和菊花药材 (见图1)。

4.1.2 对其它11厂家生产的11批牛黄上清丸及自制样品的图谱进行对比，相似度见表1。

图1 各剂型特征图谱

表1 不同厂家生产的丸剂样品和自制样品的色谱图相似度

4.2 片剂特征图谱的生成 色谱图和相似度计算结果表明，不同厂家生产的10批样品及自制样品相似度见表2，色谱图差异较大。因片剂生产厂家分散，样品间差异较大，各样品通过相似度软件生成的平均图谱作为牛黄上清片的特征图谱 (见图1)。

表2 不同厂家生产的片剂样品和自制样品的色谱图相似度

4.3 胶囊剂特征图谱的生成 5批胶囊剂由同一厂家生产，相似度见表3(表中，S6为实验室自制样品)，软件生成的图谱作为特征图谱 (见图1)。

表3 同一厂家生产的胶囊剂样品及自制样品色谱图相似度

4.4 实际得到的各剂型特征图谱 各图中标有相同序号的峰为保留时间相同的峰。其中牛黄上清丸特征图谱有19个共有峰，牛黄上清片特征图谱有13个共有峰，牛黄上清胶囊有8个共有峰。

5 结果分析

5.1 从牛黄上清丸的测定结果来看，同一生产厂家的样品色谱图相似度范围为0.998～1.000，说明制剂工艺及产品质量很稳定;不同生产厂家的10批牛黄上清丸之间的特征图谱相似度范围为0.001～1.000，因大蜜丸生产工艺中不含有提取、浓缩步骤，制剂工艺较为简单，故认为这种差异主要由为众厂家使用的饮片的质量良莠不齐造成。故认为解决的方法主要有:含挥发油药材的质量标准应增加对挥发油或其主要化学成分的检验内容;制剂质量标准中应增加挥发油 (主要)成分的定性鉴别项目。

5.2 牛黄上清片制剂工艺中将连翘、荆芥穗、薄荷三味提取挥发油，作为重点关注的挥发油峰 (1、8、10号峰)均未明显检出 (13～18号峰明显检出);牛黄上清胶囊制剂工艺中将连翘、荆芥穗、薄荷、白芷、川芎、当归、菊花七味提取挥发油，作为重点关注的挥发油峰 (1、8、10、13～18号峰)均未明显检出。结果说明制剂工艺增加提取挥发油后，挥发油反而会损失。认为原因可能为未按工艺要求提取并处理挥发油、所用药材质量较差，或挥发油喷入后，因包材的原因，逐渐损失减少至无法明显检出。基于牛黄上清片和胶囊的检测结果，为提高产品质量，建议［7-8］:将挥发油作为中间原料，对其制定质量标准，在投料前进行检验;尽量进行妥善处理如β-环糊精包合等技术;质量标准应增加挥发油特征图谱的检验项目。

5.3 本实验中，通过峰归属试验，发现的质量问题主要为以其它药材代替处方药材投料，如以樟脑全部或部分代替冰片［9-10］、重要的色谱峰缺失等。特征图谱可以有效鉴别和评价产品的质量优劣，显示产品质量的稳定性和批间均一性［11-13］。特征图谱在中药制剂中的应用目前尚不广泛，本实验为制剂特征图谱的初步研究，方法的成熟和发展还有待于进行更进一步的试验。

5.4 因挥发油特点决定样品溶液最后定容体积不宜过大，又因中药制剂多数处方较大，成分复杂，故本实验中样品处理采用蒸馏法提取挥发油的方法，较溶剂直接提取法合理。

［1］吴立军．天然药物化学 ［M］．2版．北京:人民卫生出版社，2000:302．

［2］曹春林，崔万钧．中药新剂型的研制概况 ［J］．中药通报，1981(3):37-40．

［3］郭 平，楼一层，林 鑫，等．复方舒咳糖浆的高效液相色谱特征图谱［J］．中国医院药学杂志，2009，29(3):180-182．

［4］孔 杰，姚 健，达文燕，等．连翘挥发油化学成分的研究［J］．西北师范大学学报，2001，37(4):77-81．

［5］于 萍，邱 琴，催兆杰，等．GC-MS法分析山东荆芥穗挥发油成分 ［J］．中成药，2002，24(2):57-60．

［6］刘金荣，李 萍，李毓倩．三种野生薄荷挥发油化学成分的测定 ［J］．石河子医学院学报，1995，17(1):16-17．

［7］袁 媛，陈光英．中药复方制剂制备工艺中挥发油取舍问题探讨 ［J］．热带药学，2007(7):83-85．

［8］贾晓斌，高成林，陈 彦，等．小儿腹泻暖脐散中挥发油的提取及其β-环糊精包合物的制备研究 ［J］．中成药，2009，31(12):1852-1854．

［9］韦 娟，罗俭华．复方丹参片中冰片伪品樟脑的检出 ［J］．基层中药杂志，1999，13(1):6．

［10］魏晓舒，高国英，葛晓莹．气相色谱法检测复方丹参片中樟脑残留量研究 ［J］．中国药品标准，2010，11(4):259-262．

［11］高 旋，宋 敏，庄 莹，等．雷公藤药材及制剂的HPLC特征图谱研究 ［J］．药物分析杂志，2009，29(5):702-709．

［12］单 臻，赵陆华，屠 颖，等．肾宝片中挥发油GC指纹图谱研究 ［J］．中国天然药物，2005，3(3):158-161．

［13］胡汉昆，刘薇芝，刘 萍，等．中药特征图谱技术在中药中的应用 ［J］．中国医院药学杂志，2009，29(11):936-938．