高效液相色谱法测定复方昆丹胶囊中6种主要成分

陈 婷， 赵瑞芝， 黎 雄， 黄 斌， 朱亚珍， 郑广娟*

(1.广东省中医院，广东广州510006;2.广州中医药大学，广东广州510006)

代谢综合征 (metabolic syndrome)是以胰岛素抵抗 (insulin resistance)为中心环节的一组代谢紊乱性疾病，是各种代谢危险因素在同一个体中聚集的状态。近年来，代谢综合征发病率逐年递增，研究表明，我国代谢综合征患病率已高达14%～18%，而在糖尿病患者中甚至高达60% ～80%［1］。

昆丹胶囊由白术、制首乌等药物组成，针对代谢综合征在中医理论指导下，以益气活血、消湿蠲痰、健脾补肾为治疗原则［2］，用于治疗高血压、高血脂、糖尿病、肥胖等代谢综合征［3-9］。文献报道中对苯甲酰芍药苷、5，7-二甲氧基香豆素、白术内酯Ⅲ、大黄素、白术内酯Ⅰ和大黄素甲醚的单一成分或2种成分进行HPLC定量测定的方法较多［10-12］，但尚未见同时对6种成分进行HPLC定量测定的方法。本实验采用HPLC法同时测定白芍、佛手、制首乌和白术的6种有效成分，对控制和提高昆丹胶囊的质量具有重要的意义。

1 仪器与试药

Waters2695高效液相色谱仪，Waters2998PDA检测器，METTLER AB135-S电子分析天平，BRANSON 8510超声清洗仪。

苯甲酰芍药苷对照品 (天津一方科技有限公司，批号20110315)，5，7-二甲氧基香豆素 (sig-ma公司，批号05398PJ)，白术内酯Ⅲ (广州万阡源实验设备有限公司，批号20101013)，大黄素(广州市药品检验所，批号110756-200110)，白术内酯Ⅰ (广州万阡源实验设备有限公司，批号20090423)，大黄素甲醚 (广州市药品检验所，批号110758-201013)甲醇、乙腈为色谱纯，水为超纯水，其它试剂均为分析纯。昆丹胶囊为实验室自制。

2 方法与结果

2.1 色谱条件 Agilent TC-C18色谱柱 (4.6 mm×250 mm，5 μm)，以乙腈 (A)-水 (B)为流动相，进行梯度洗脱 (0～6 min，35% ～40%A，6～10 min，40% ～55%A，10～15 min，55% ～65%A，15～26 min，65% ～66%A，26～27 min，66%～70%A);体积流量1.0 mL/min;进样量10 μL;柱温30℃;检测波长220 nm。

2.2 溶剂的制备

2.2.1 混合对照品的制备 取苯甲酰芍药苷对照品、5，7-二甲氧基香豆素对照品、白术内酯Ⅲ对照品、大黄素对照品、白术内酯Ⅰ对照品及大黄素甲醚对照品适量，精密称定，置棕色量瓶中，加甲醇制成每1 mL含苯甲酰芍药苷对照品0.011 0 mg/mL、含5，7-二甲氧基香豆素0.005 7 mg/mL、含白术内酯Ⅲ对照品0.007 6 mg/mL、含大黄素对照品0.004 7 mg/mL、含白术内酯Ⅰ对照品0.003 7 mg/mL及含大黄素甲醚对照品0.001 8 mg/mL的混合对照品溶液。

2.2.2 供试品制备 取本品适量，精密称取，置100 mL平底烧瓶中，加入10倍量的75%乙醇浸泡1 h，加热回流提取1 h，趁热过滤，残渣加入8倍量的75%乙醇加热回流1 h，趁热过滤，合并提取液，定容至250 mL量瓶中。取10 mL75%乙醇液，水浴蒸干，二氯甲烷萃取3次，合并二氯甲烷液，蒸干，甲醇溶解，转移至10 mL量瓶中，并稀释至刻度，摇匀，即得。

2.2.3 阴性样品溶液 按2.2.2项下方法制成分别缺白芍、佛手、白术和制首乌的4份阴性样品溶液，在2.1项色谱条件下吸取10 μL进样。结果表明，阴性样品图谱中，在与样品图谱中6种被测成分相同位置上无峰出现，表明无阴性干扰。对照品、样品及阴性样品色谱图见图1。

图1 对照品，样品和阴性样品HPLC色谱图Fig.1 HPLC chromatograms of reference substance，sample and negative sample

2.3 系统适应性试验 分别吸取对照品溶液和供试品溶液及阴性样品溶液各10 μL注入高效液相色谱仪，按2.1项下色谱条件记录色谱图，结果苯甲酰芍药苷，5，7-二甲氧基香豆素，白术内酯Ⅲ，大黄素，白术内酯Ⅰ，大黄素甲醚的保留时间分别为8、13、16、18、21、28 min左右，阴性对照样品对测定无干扰，色谱图见图1，苯甲酰芍药苷峰，5，7-二甲氧基香豆素峰，白术内酯Ⅲ峰，大黄素峰，白术内酯Ⅰ峰，大黄素甲醚峰与邻近峰达到基线分离，分离度良好 (R＞1.5)。

2.4 线性关系考察 精密吸取2.2.1项下混合对照品溶液 2、4、6、8、10、12、14、16、18、20 μL进样，以对照品进样量 (μg)对峰面积进行线性回归，求得回归方程。苯甲酰芍药苷、5，7-二甲氧基香豆素、白术内酯Ⅲ、大黄素、白术内酯Ⅰ、大黄素甲醚回归方程分别为:

结果表明苯甲酰芍药苷，5，7-二甲氧基香豆素，白术内酯Ⅲ，大黄素，白术内酯Ⅰ，大黄素甲醚质量浓度分别在 2.20～22.0 μg/mL，1.13～11.3 μg/mL，1.52 ～ 15.2 μg/mL，0.95 ～ 9.5 μg/mL，0.75 ～ 7.5 μg/mL，0.35 ～ 3.5 μg/mL (r ＞0.999 9)范围内与峰面积具有良好的线性关系。

2.5 精密度试验 取苯甲酰芍药苷、5，7-二甲氧基香豆素、白术内酯Ⅲ、大黄素、白术内酯Ⅰ、大黄素甲醚混合对照品10 μL，连续进样6次，苯甲酰芍药苷、5，7-二甲氧基香豆素、白术内酯Ⅲ、大黄素、白术内酯Ⅰ、大黄素甲醚对照品RSD(n=6)分别为2.5%、0.4%、0.4%、0.4%、0.6%、0.8%。

2.6 稳定性试验 取同一供试品溶液分别在0、2、4、6、8、10、12、24 h进样测定，结果苯甲酰芍药苷、5，7-二甲氧基香豆素、白术内酯Ⅲ、大黄素、白术内酯Ⅰ和大黄素甲醚峰面积的RSD(n=6)分别为 2.0%、0.7%、0.7%、1.9%、1.1%、1.4%。表明供试品溶液中苯甲酰芍药苷，5，7-二甲氧基香豆素，白术内酯Ⅲ，大黄素，白术内酯Ⅰ和大黄素甲醚在24 h内稳定。

2.7 重复性试验 取6份昆丹胶囊样品，精密称定，按2.2.2项下方法制备供试品溶液，依法测定，进样量为10 μL，结果样品中苯甲酰芍药苷、5，7-二甲氧基香豆素、白术内酯Ⅲ、大黄素、白术内酯Ⅰ、大黄素甲醚平均质量分数分别为0.086、0.061、0.100、0.064、0.034、0.021 mg/g，RSD分别为 2.5%、1.3%、1.2%、1.9%、1.1%、0.7%。

2.8 加样回收率试验 精密称定已知含有量的样品适量，共9份，按对照品加入量为样品中相应成分含有量的80%、100%、120%分别精密加入苯甲酰芍药苷对照品0.002 3、0.002 9、0.003 5 mg/mL，5，7-二 甲 氧 基 香 豆 素 对 照 品 0.001 6、0.002 1、0.002 5 mg/mL，白术内酯Ⅲ对照品0.002 7、0.003 4、0.004 0 mg/mL，大黄素对照品0.001 7、0.002 2、0.002 6 mg/mL，白术内酯Ⅰ对照品0.000 9、0.001 2、0.001 4 mg/mL，大黄素甲醚对照品0.000 6、0.000 7、0.000 8 mg/mL，各3份。按上述供试品溶液的制备方法制备，依法测定，计算加样回收率，结果见表1。

表1 加样回收率试验结果 (n=3)Tab.1 Results of recovery tests(n=3)

2.9 样品测定 取3个批号的样品，按照2.2.2项下方法制备供试品溶液，在2.1项色谱条件测定，结果见表2。

表2 样品中6种成分的测定结果(n=3)Tab.2 Results of sample determination(n=3)

3 讨论

3.1 中药材和中药复方成分种类复杂，研究中常会碰到同时测定多个成分且各成分的紫外吸收不同的问题，本实验采用220nm为检测波长［13］，能够很好的兼顾复方中各类成分。

3.2 在实验过程中，曾分别采用乙醇、甲醇超声提取和乙醇水浴加热回流，考察提取率，结果显示75%乙醇水浴加热回流提取各成分含有量较高，故确定75%乙醇回流为提取方案，提取省时完全，操作简单，重现性好。此外，摸索萃取条件时，曾采用正丁醇、三氯甲烷、二氯甲烷、乙酸乙酯等溶剂，结果正丁醇、乙酸乙酯得到的有效成分较低，而三氯甲烷和二氯甲烷较佳，但三氯甲烷毒性较大，故采用二氯甲烷代替，效果同等，毒性更小，简单易操作。

3.3 在流动相的选择中，采用了不同比例的甲醇-水、甲醇-磷酸、乙腈-水、乙腈-磷酸进行梯度洗脱［14］，经过实验分析，综合考虑了分离效果、基线平稳、操作方便性等情况，最终确定乙腈-水为最佳流动相，并摸索了等度、梯度条件［15］，最后确定了本实验中的梯度系统，苯甲酰芍药苷、5，7-二甲氧基香豆素、白术内酯Ⅲ、大黄素、白术内酯Ⅰ、大黄素甲醚6种成分出峰快，与杂质峰的分离度均达到1.5以上。

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