酶解超声辅助卵磷脂的提取工艺

赵彦巧，李建颖，吴子健，王文忠

（天津商业大学生物技术与食品科学学院，天津市食品生物技术重点实验室，天津300134）

蛋黄卵磷脂在我国的市场占有量还非常少。随着人民生活水平的提高，大力开发卵黄卵磷脂提取技术，提高鸡蛋的加工水平和商品价值，改善蛋黄卵磷脂工艺，使其产率提高，降低成本成为迫在眉睫的任务。目前制备蛋黄卵磷脂一般采用有机溶剂萃取法、柱层析法、乙酰化法[1-2]，超声辅助和酶解法可以使产率大大提高[3-4]。

本实验中将采用酶解超声辅助法提取蛋黄卵磷脂。以蛋黄粉为原材料，选择胃蛋白酶最佳浓度后对超声条件进行选择，并通过正交实验确定蛋黄卵磷脂的提取最佳工艺，提高卵磷脂的提取率。

1 材料与方法

1.1 材料与设备

蛋黄粉：购于北京金健力蛋粉厂；钼酸铵、磷酸二氢钾、1-氨酸-2-萘酚-4-磺酸、亚硫酸氢钠、无水亚硫酸钠、四硼酸钠（pH 9.18）、混合磷酸盐（pH 6.86）、乙醇95%、无水乙醇等试剂：购于天津市江天化工技术有限公司，皆为分析纯；丙酮、硫酸：购于天津市化学试剂批发公司，分析纯；胃蛋白酶：购于中国上海化学试剂有限公司，酶活力（U/g）≥1 200.0。

FA1004 型电子分析天平：上海精密科学仪器有限公司；BKH-C 玻璃仪器气流烘干器：长城科工贸有限公司；DGG-H-3 型电热鼓风干燥箱：天津市天宇实验仪器有限公司；RE-52A 旋转蒸发仪：上海亚英生化仪器厂；SK5210LHC 超声波清洗器：上海科导超声仪器有限公司；XMTD-204 型数显式电热恒温水浴锅：天津市欧诺仪器仪表有限公司；PHS-3B 型精密pH 计：上海精密科学仪器有限公司；UV-7504 型紫外可见分光光度计：上海欣茂仪器有限公司；DL-6000 型低速冷冻离心机：上海安亭科学仪器厂。

1.2 提取实验方法

取一定量蛋黄粉，加入去离子水并不停搅拌，使蛋黄粉充分搅匀。用盐酸调pH 至2，加入胃蛋白酶充分搅拌，使其酶解。待酶解反应充分后，对酶解液进行破乳[4]，用氢氧化钠调pH 至5，90 ℃水浴15 min。所得蛋黄液离心15 min（4 000 r/min），获取第二层胶状脂质体。取一定量酶解离心后的胶状脂质体，加入溶剂进行超声提取，超声频率35 kHz。提取液旋蒸后，得粗卵磷脂，粗卵磷脂乙醇溶液用丙酮洗涤多次，直至洗涤液无色，真空干燥即得精制卵磷脂。

1.3 卵磷脂的分析方法

由于卵磷脂是一种含磷的生理物质，因此采用钼蓝比色法测定卵磷脂含量，即用钼酸铵定磷法测定产品中有机磷的含量，间接反映卵磷脂的含量。

2 结果与讨论

2.1 蛋黄粉原料成分常规分析

蛋黄粉原料成分的常规分析结果见表1。

表1 蛋黄粉原料成分Table1 The content of egg yolk powder%

2.2 胃蛋白酶浓度对卵磷脂提取的影响

胃蛋白酶的添加量不同，蛋黄粉中蛋白质的肽键水解程度不同，蛋白质和脂类的分离受到影响，从而影响了脂类在乙醇的溶解，导致卵磷脂的提取率不同。胃蛋白酶浓度对蛋白质水解程度的影响曲线见图1。

随着酶浓度的增加，磷脂的提取率不断增加。这是由于随着酶浓度的增加，胃蛋白酶和底物接触的机会大大增加，在相同时间内水解的分子数也随之增加，可以使磷脂分离得更快、更彻底。当胃蛋白酶浓度到6.25 mg/mL 时，磷脂的提取率最大。但是，当酶的浓度超过6.25 mg/mL 后，酶浓度的增加对提取率的影响很小。此时酶的浓度超过与底物反应所需酶量，一部分酶分子无底物与之结合，因此提取率随酶浓度的增加变化不大[5]。为了节约成本和资源，确定胃蛋白酶最佳浓度为6.25 mg/mL。

2.3 温度对卵磷脂提取率的影响

考察了温度对卵磷脂产率影响，结果见图2。

图2 温度对卵磷脂提取率的影响Fig.2 Effect of temperature on lecithin extraction

可以看出，从25℃开始卵磷脂提取率随温度的提高而逐渐增加，达到45℃时提取率达到最大，超过45℃反而下降。卵磷脂的提取过程是固-液相之间的扩散过程。当温度较低时，适当提高提取时的温度可以增加分子的动能，使溶质扩散的速度加快，从而使提取率增加[6]。但高于45℃后，提取率反而随温度升高而下降。提取率下降的原因可能是由于卵磷脂溶于乙醇是放热反应，卵磷脂的溶解度随温度的上升而减少，也可能是温度升高加速卵磷脂氧化分解。因此在卵磷脂的提取过程中，应该保持一定的温度范围，保证卵磷脂有较高的提取率。由图中可以看出提取卵磷脂的最适温度在45℃。

2.4 时间对卵磷脂提取率的影响

图3 时间对卵磷脂产率的影响Fig.3 Effect of time on lecithin extraction

提取时间对卵磷脂提取的影响见图3。随着时间的增长，卵磷脂的提取率不断提高。在30 min 时达到最大。超过30 min 后，卵磷脂提取率有小幅下降之后缓慢上升。这是由于需要提取一定时间后，原料才能全部溶开与乙醇充分结合，从而破坏脂质和蛋白质间的共价键，卵磷脂的提取率有所提高。但超过40 min后提取率反而下降，可能是在提取过程中存在卵磷脂的氧化和乙醇挥发，从而影响了卵磷脂提取率。在实验范围内卵磷脂最佳提取时间为30 min。

2.5 溶剂浓度对卵磷脂提取率的影响

提取卵磷脂常用溶剂为乙醇，但不同浓度的乙醇提取卵磷脂的效果不同。考察了浓度为60%、70%、90%、95%、100%的乙醇对卵磷脂提取的影响，结果见图4。

图4 乙醇浓度对卵磷脂产率的影响Fig.4 Effect of concentration of ethanol on lecithin extraction

可以看出，乙醇浓度在60%到90%时，卵磷脂提取率随乙醇的浓度升高而升高，在到达90%达到最高；当乙醇浓度超过90%时，随着乙醇浓度的升高卵磷脂的提取率反而降低。这是由于在乙醇浓度低的时候，溶剂的极性和卵磷脂的极性相差较大，随着浓度的提高，两者的性质越来越相似，卵磷脂在乙醇中的溶解度也越来越大，从而卵磷脂的提取率也会随之增加。但超过90%后时，两者的性质相差也越来越大，因此卵磷脂的提取率会逐渐下降。所以在保证卵磷脂产率的前提下，考虑原材料、经济成本综合因素后选取90%乙醇作为提取蛋黄卵磷脂溶剂。

2.6 溶剂用量对卵磷脂提取率的影响

向一定量的原料液中（原始蛋黄粉5 g）分别加入20 mL、40 mL、80 mL、120 mL、160 mL 乙醇进行提取，溶剂用量对卵磷脂提取率的影响见图5。

由图5 可见，乙醇用量在20～80 mL 时卵磷脂的提取率随乙醇用量增加大幅提高，当达到80 mL，即料液比为1︰16 时卵磷脂提取率最高；但超过80 mL 后，卵磷脂提取率变化幅度不大。这是由于随着乙醇用量的增加，可以使原料液中的卵磷脂与乙醇融合充分。但是从经济角度考虑，提取时溶剂用量过大，导致原材料浪费，成本提高，而产率变化不大。因此选用适量的提取剂可以获得更大的效益。可以看出乙醇最佳用量为80 mL，即料液比为1︰16（g/mL），1 g 蛋黄粉所需要乙醇16 mL。

2.7 正交试验优选提取工艺

根据单因素试验的结果，各因素分别选取3 个水平进行酶解超声辅助提取卵磷脂的正交试验，其结果见表2。

表2 L9（34）正交试验因素水平表及极差分析Table 2 Results of L9（34）orthogonal experiments

比较三个因素的极差R

C（乙醇浓度）B（时间）D（料液比）A（温度）

由表2 可以看出，影响蛋黄卵磷脂提取率的4 个因素的显著关系从主到次的顺序为乙醇浓度、时间、料液比、温度，酶解超声辅助提取卵磷脂的最佳工艺为A1B1C1D1，即温度为35 ℃，反应时间30 min，乙醇浓度为90%，乙醇量为60 mL（料液比为1︰12（g/mL）），此时卵磷脂的提取率最高为80.64%。

3 结论

以蛋黄粉为原料，通过酶解超声辅助法对蛋黄卵磷脂的提取进行研究。选取了胃蛋白酶的最适添加量，并对超声温度、时间、乙醇浓度、料液比进行研究，通过正交试验对影响卵磷脂的四个因素进行考察，优化卵磷脂提取工艺。酶解超声辅助法的最佳工艺条件为：酶浓度6.25 mg/mL，超声频率35 kHz，温度为35 ℃，时间30 min，乙醇浓度为90%，料液比为1︰12（g/mL）。此时卵磷脂的提取率为80.64%。

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