Fcα受体在类风湿性关节炎人成纤维样滑膜细胞的表达与功能研究

喻 晶 聂李平 颜存粮 刘小平 桂耀庭

类风湿性关节炎(rheumatoid arthritis，RA)是一种以关节滑膜炎为主要临床表现的慢性全身性自身免疫性疾病，其病因及发病机制目前尚未完全明了。至今，RA尚无特效治疗方法，一旦发病，不易治愈，常常终身罹患，因此进一步深入探讨RA的发病机制对于其治疗具有重要意义。

IgA型类风湿因子(IgA－RF)在类风湿性关节炎(RA)中具有重要的临床意义。研究表明，以IgA－RF增高为主的RA患者其病变程度更严重，对抗TNF－α生物制剂的疗效差［1，2］。在RA的早期检测出IgA－RF升高预示着病程进展更快，预后较差［3］。目前还不清楚为什么IgA－RF与疾病的严重性相关。存在于关节滑液的IgA－RF，如何作用于关节滑膜的成纤维样滑膜细胞(FLS)，作用后是否会产生生物效应?对RA起促进作用还是抑制作用?FLS上是否存在IgA的受体?目前尚未见报道。本研究从基因和蛋白水平探讨 IgA受体，即 Fcα受体(FcαR，CD89)在类风湿性关节炎人成纤维样滑膜细胞(RA FLS)的表达，并对其功能进行研究，以阐明IgA及其受体在RA发生中的作用，为探讨RA的发病机制及治疗措施提供新的思路。

材料与方法

1.主要材料与试剂:类风湿性关节炎人成纤维样滑膜细胞(RA FLS)购自美国cell applications公司(San Diego，CA，USA)，U937(人髓系白血病细胞株)购自美国ATCC，DMEM及RPMI1640细胞培养液，TRIzol、反转录酶MMLV、oligo dT、dNTPs、RNasin、Taq DNA酶为美国Invitrogen公司产品，分泌型IgA(sIgA)和TNF－α购自美国Sigma公司，单聚体IgA (m IgA)及人IL－6 ELISA试剂盒为美国Piece公司产品。

2.细胞培养:类风湿性关节炎人成纤维样滑膜细胞培养于含10%的胎牛血清(FBS)、105U/L青霉素及105U/L链霉素的DMEM培养液中。每3天换液1次，细胞达到融合后传代培养，3～7代的细胞用于实验。U937细胞株用含10% 的胎牛血清、105U/L青霉素及105U/L链霉素的RPMI 1640培养液于37℃、5%的CO2的培养箱中培养，作为Fcα受体的阳性对照。

3.免疫荧光染色:类风湿性关节炎人成纤维样滑膜细胞生长于用胶原(0.2mg/ml)处理过的载玻片上，达到80%的细胞融合后，磷酸盐缓冲液(PBS)洗2次，4%多聚甲醛4℃固定细胞20min，PBS洗3次，用含5%马血清、0.2%Triton X－100的PBS于37℃孵育60min，以阻断非特异性反应。加1∶25 Fcα受体的单克隆抗体(BD Pharmingen，USA)37℃孵育60min，PBS洗3次，加FITC标记的驴抗鼠IgG(Jackson Laboratories，USA)，37℃孵育30min，PBS洗3次，用缓冲甘油封片，荧光显微镜下观察。

4.反转录－多聚酶链式反应(RT－PCR):采用TRIzol RNA提取液提取类风湿性关节炎人成纤维样滑膜细胞和U937的总RNA。取总RNA 3μg，加入oligo dT 1μl，(500μg/ m l)、10mmol/L dNTPs 1μl，加 DEPC处理水至12μl，置于65℃孵育5min，迅速置冰上，加入5×反转录缓冲液4μl、RNasin 1μl、M－MLV反转录酶1μl(200U/μl)，加水至20μl，37℃孵育50min，70℃15min，得到反转录模板cDNA。

按照Genebank的Fcα受体基因序列，选择Fcα受体的IgA结合序列区段，设计引物。上游为:5'CCT CAG TCTGGG GCT TTC TTT 3'，下游引物为:5'CTTGTT TGCGTCCATGTG GTC 3'，扩增产物大小241bp。引物由中国上海生物工程公司合成。取反转录反应产物cDNA 5μl，加入10×PCR缓冲液5μl、10mmol/L dNTPs 1μl、PCR特异性引物(50μmol/L)各0.5μl、Taq DNA聚合酶0.4μl(5U/μl)，加水至50μl。PCR反应条件为:94℃预变性3min;94℃变性45s、55℃退火30s、72℃延伸90s，共30个循环;72℃延伸10min。1.5%琼脂糖凝胶分离 RT－PCR产物，凝胶成像分析仪(Dolphin DOC，Wealtec，USA)处理图像。

5.RA FLS细胞上清液中IL－6含量测定:细胞培养至80%融合，改用不含胎牛血清的DMEM细胞培养液，加入m IgA(10μg/ ml)，sIgA(10μg/m l)，TNF－α(10ng/ml)，培养12h后，取细胞培养上清液，13000r/min离心10min，留上清于－80℃ 保存备用。按照试剂说明书检测细胞上清液中IL－6的含量。

6.统计学方法:采用SPSS 13.0统计软件进行配对t检验，以P＜0.05为差异有统计学意义。

结果

1.IgA受体在类风湿性关节炎人成纤维样滑膜细胞(RA FLS)的表达:(1)RT－PCR结果:用RTPCR的方法在基因水平检测Fcα受体mRNA在RA FLS上的表达，结果显示阳性对照细胞U937及RA FLS的RT－PCR产物在241bp处均可见明显的条带(图1)，表明Fcα受体在类风湿性关节炎人成纤维样滑膜细胞上有表达。(2)免疫荧光染色结果:用Fcα受体的单克隆抗体对RA FLS进行免疫荧光染色，在蛋白水平检测Fcα受体在RA FLS的表达，结果显示类风湿性关节炎人成纤维样滑膜细胞上存在Fcα受体(图2)。

2.IgA对RA FLS分泌IL－6水平的影响:对照、m IgA、sIgA、TNF－α、sIgA+TNF－α、m IgA+TNF－α组的IL－6含量分别为153.12±41.98、206.27± 46.06、600.02±42.36、880.02±26.06、1290.02± 134.56、878.12±62.82pg/ml。sIgA(10μg/m l)与RA FLS孵育12h后，细胞上清液中的IL－6水平明显高于空白对照组，差异具有显著性(t=18.82，P＜0.01)。m IgA(10μg/ml)与RA FLS孵育12h后，细胞上清液中的IL－6的含量与空白对照组相比，无统计学差异(t=2.59，P＞0.05)。TNF－α(10ng/ml)能明显增加IL－6含量(t=34.33，P＜0.01)。sIgA (10μg/ml)+TNF－α(10ng/ml)同时与RA FLS孵育12h后，其上清液中的IL－6含量明显高于sIgA或TNF－α单一组(t分别为9.08和6.16，P＜0.01)。

讨论

Fcα受体属于免疫球蛋白超家族，主要表达于中性粒细胞、单核细胞、嗜酸性粒细胞、库普弗细胞、树状突细胞，其是否在类风湿性关节炎人成纤维样滑膜细胞表达，目前国内外尚未见报道。本研究采用RT－PCR及免疫荧光技术，从基因和蛋白水平均检测到Fcα受体在RA FLS的表达，表明RA FLS存在Fcα受体。

RA FLS位于关节滑膜内层，占关节滑膜细胞的70%～80%。目前已经确定RA FLS是介导RA关节破坏病理过程的主要细胞［4］。TNF－α和IL－6在RA发病中起着极其关键作用，TNF－α可刺激RA FLS增生活化，增加IL－6分泌，IL－6促进破骨细胞的聚集，对骨组织造成侵蚀破坏［4～6］。IL－6分泌水平与RA疾病的严重性和活动性密切相关，采用IL－6的抑制剂可明显改善RA患者的症状［6，7］。本研究发现Fcα受体存在于RA FLS，IgA与其结合后是否会产生生物学效应?实验结果显示，sIgA作用于RA FLS后，明显增高细胞分泌IL－6水平(P＜0.01)。sIgA与TNF－α同时作用于RA FLS后，IL－6的分泌量明显高于sIgA或TNF－α的单一作用，说明两者相加可产生协同效应，促使IL－6分泌增加。m IgA使RA FLS分泌IL－6的量高于对照组，但其差异无显著性，与TNF－α合用对IL－6的生成无协同作用。SIgA使IL－6增高的原因可能是因为sIgA呈二聚体形式，其比单聚体IgA(m IgA)对Fcα受体有更强的结合能力和作用效果。而存在于关节滑膜液中的IgA－RF，主要以多聚体形式存在。

虽然目前类风湿性关节炎的病因和发病机制尚未完全明了，但大量研究表明细胞因子在RA关节滑膜病变中起了核心作用，以细胞因子为靶位的生物制剂已应于临床治疗［4，7］。新型的IL－6拮抗剂Tocilizumab能明显改善RA症状、关节损伤和全身表现，对传统抗风湿药(DMARD)或TNF－α抑制剂疗效不佳的患者，可改善症状，说明IL－6在类风湿性关节炎中起了重要的病理作用。从本实验的研究结果推测以IgA－RF增高为主的RA患者其病变程度更严重，对抗TNF－α生物制剂的疗效差，可能与患者的RA FLS分泌IL－6水平明显增高有关，采用抗IL－6的生物制剂可能使患者受益。

1 Ate■A，Kinikli G，Turgay M，et al.Effects of rheumatoid factor isotypes on disease activity and severity in patientswith rheumatoid arthritis:a comparative study［J］.Clin Rheumatol，2007，26(4):538－545 2 Bobbio－Pallavicini F，Caporali R，AlpiniC，et al.High IgA rheumatoid factor levels are associated with poor clinical response to tumour necrosis factor alpha inhibitors in rheumatoid arthritis［J］.Ann Rheum Dis，2007，66(3):302－307

3 Jónsson T，Valdimarsson H.Clinical significance of rheumatoid factor isotypes in seropositive arthritis［J］.Rheumatol Int，1992，12(3):111－113

4 Bartok B，Firestein GS.Fibroblast－like synoviocytes:key effector cells in rheumatoid arthritis［J］.Immunol Rev，2010，233(1):233－255

5 Yoshitake F，Itoh S，Narita H，et al.Interleukin－6 directly inhibits osteoclast differentiation by suppressing receptor activator of NF－kappaB signaling pathways［J］.J Biol Chem，2008，283(17):11535－11540

6 Knudsen LS，Ostergaard M，Baslund B，et al.Plasma IL－6，plasma VEGF，and serum YKL－40:relationship with disease activity and radiographic progression in rheumatoid arthritis patients treated with infliximab and methotrexate［J］.Scand JRheumatol，2006，35(6):489－491

7 Tak PP，Kalden JR.Advances in rheumatology:new targeted therapeutics［J］.Arthritis Res Ther，2011，13(Suppl)1:S5