昆虫杆状病毒表达系统生产流感疫苗的研究进展

李晶梅，靖志强，秦红刚，薛 霜，漆世华，谢红玲，吴玉石

(武汉中博生物股份有限公司，武汉 430070)

流感病毒是一种造成人类及动物流行性感冒的RNA病毒，分为A、B、C三型。禽流感病毒属A型流感病毒，主要感染禽类，每年造成养禽业巨大损失。1997年首次证实了禽流感病毒可以直接从禽传播到人[1]，此后又有多起人接触发病禽类感染禽流感、发病死亡的报道。禽流感突破种间屏障对人类易感以及2009年墨西哥猪流感爆发，都使得流感再次成为人们关注的焦点。预防接种疫苗是防控季节性流感和大流行流感的首选办法。目前临床应用的流感疫苗以鸡胚苗为主，但鸡胚苗的生产有诸多限制因素，人们一直试图开发新型流感疫苗，以昆虫杆状病毒表达系统(Baculovirus expression vector system，BEVS)表达流感病毒样颗粒为核心技术的新型流感疫苗已成为国内外研发热点。

1 昆虫杆状病毒表达系统表达流感病毒样颗粒

病毒样颗粒(Virus-like particles，VLPs)是各种表达系统表达的由某种病毒的一个或多个结构蛋白自行装配而成的形态结构类似于病毒粒子的空心蛋白颗粒。VLPs不含病毒核酸，不能自行复制，但作为抗原，以病毒感染一样的途径递送给免疫细胞，有效地诱导机体免疫系统产生免疫反应。流感病毒VLPs是由流感病毒的主要结构蛋白在细胞膜上相互作用出芽形成的。因此，流感病毒VLPs为胞外表达，其研究焦点也集中在基质蛋白M1，以及血凝素(HA)、神经氨酸酶(NA)和基质蛋白M2三种跨膜蛋白上。

昆虫杆状病毒表达系统是一种能够高效表达外源基因的真核表达载体系统。杆状病毒基因组较大，可容纳大片段外源基因，且具有多个天然启动子，也易于构建新的人工启动子，实现多基因表达，因此可同时插入多个外源基因表达VLPs。很多研究机构均利用BEVS成功表达了VLPs，如猴或人的免疫缺陷综合症病毒VLPs[2-3]、人乳头状瘤病毒 VLPs[4]、肝炎病毒 VLPs[5]、轮状病毒 VLPs[6]、埃博拉病毒VLPs[7]等。目前，采用BEVS组装流感病毒VLPs主要有两种方法:一种是分别构建含1～2个流感结构蛋白基因的重组杆状病毒，将含不同流感结构蛋白基因的重组杆状病毒共感染到同一宿主细胞组装成VLPs[8-11];另一种是将多种结构蛋白的基因插入到同一杆状病毒，感染宿主细胞组装成 VLPs。HA、NA、M1、M2 四种结构基因[12-13]或 HA、NA、M1 三种结构基因构建到一个杆状病毒结构内[14-16]，表达流感病毒VLPs都获得了成功。电镜下，表达的流感病毒VLPs与流感病毒粒子大小相当、形态学相近，并有流感HA蛋白的典型突起[10，12，16]。

2 BEVS制备的流感病毒VLPs疫苗

BEVS表达流感病毒VLPs，多以疫苗研发为目的。构建的流感病毒VLPs是否具有良好免疫活性是研发中关注的焦点。VLPs单价疫苗、多价疫苗免疫原性研究显示，流感病毒VLPs与流感全病毒免疫原性相近，高于重组 HA的免疫原性[11，12，14，17-19]。也有研究称其制备的三价 VLPs 疫苗比三价全病毒灭活疫苗介导了更高的血凝抑制(HAI)抗体，并具有更广泛的交叉保护[20]。所以从免疫原性因素考虑，VLPs可以用于制备流感疫苗。

流感病毒VLPs是否适合做疫苗的抗原，还需要从不同方面进行考察，科研人员根据不同的侧重点设计了各自的实验。

2.1 交叉免疫保护效果 能产生广泛的交叉保护是优质疫苗的特性，而流感病毒VLPs是可以具备这种优势的。基于禽源H5N1流感病毒构建的VLPs，以鼠为动物模型，能够激发有效的抗体应答，保护同源禽H5N1流感病毒和异源人H5N1流感病毒的攻击[21]。H1N1流感病毒VLPs免疫组雪貂攻击H5N1流感病毒，雪貂发病，但最终全部存活，而对照组雪貂全部死亡[15]，这说明流感病毒VLPs甚至对不同亚型流感病毒也有一定的保护效果。综合来说，流感病毒VLPs对同源毒株保护效果良好，对同亚型不同分支的流感病毒有的能够保护、有的则保护效果不佳[9，18]，对不同亚型的流感病毒无保护效果或有微弱效果。

2.2 免疫剂量 流感病毒VLPs的免疫效果与免疫的 VLPs的剂量相关，高剂量 VLPs比低剂量VLPs介导了更高的针对HA的IgG抗体[14]和HAI抗体[22]，攻毒后实验动物鼻腔病毒载量更低[20]。当达到一定量后，再提高VLPs的剂量，不会再有免疫保护效果的提升。

2.3 接种方式 接种方式研究集中在鼻腔接种和肌肉注射接种两种免疫方式。不同研究机构、不同毒株、不同衡量指标得到了相同的结论，即鼻腔接种优于肌肉注射接种[15，23]。

2.4 一次免疫和加强免疫 一次免疫和加强免疫相比较，加强免疫的动物免疫保护效果更好，攻毒后体重数据优于一次免疫[10，17]。也有研究显示，一免后仅部分实验动物有HAI抗体，二免后全部有HAI抗体[20]。此类加强免疫的相关研究会为制定疫苗免疫程序提供依据。

2.5 免疫持续期 流感病毒VLPs能够引发长效保护，二免后28周特异性抗体水平未改变，二免后30周的小鼠能够抵御同源H5N1亚型高致病性禽流感的攻击[24]。免疫A/PR8 H1N1流感病毒VLPs的小鼠，也在14周后完全抵御A/PR8流感病毒型的致死性感染[19]。在动物上进行的免疫持续期的研究得到了理想的数据，但还需要临床实验数据才能最终确定VLPs疫苗能够提供有效保护的时长。

2.6 多价疫苗与单价疫苗 使用多价疫苗是拓宽保护范围的最好办法。分别表达不同亚型的流感病毒VLPs制备多价疫苗，动物实验证明多价疫苗的保护效果与单价疫苗的效果相当。VLPs制备多价疫苗能够引发特异性免疫反应，针对的是同亚型的同源株和遗传关系相近的毒株[19-20]，并且各抗原不相互拮抗。

2.7 佐剂 有研究显示，免疫纯品VLPs即可有很好的保护效果。尽管如此，各研究机构仍致力于佐剂的研究，选用了不同的佐剂意图提升流感病毒VLPs的免疫效果或节约抗原。研究显示，添加白细胞介素-12、胞苷酸鸟苷寡脱氧核苷酸(CpG ODN)、非磷脂脂质体纳米佐剂(Novasome)的流感病毒VLPs与PBS稀释的流感病毒VLPs相比较，有更好的免疫效果[8，13，22]。

综上所述，不同研究机构围绕流感病毒VLPs是否具有制备流感疫苗的特质，做了大量开发流感病毒VLPs疫苗所需的临床前研究工作。他们都构建出了有很好的免疫原性流感病毒 VLPs，如H1N1、H3N2、H9N2、H5N1亚型和 B 型流感病毒的VLPs。虽然亚型、毒株、构建方法不尽相同，但都得到了相同的结论，即含有流感主要保护性蛋白(HA和NA)的VLPs展现了流感病毒的功能特性，以其作为抗原制备疫苗免疫动物，攻毒后抵御流感病毒的攻击、抑制流感病毒复制。

3 昆虫杆状病毒表达系统制备流感病毒VLPs疫苗的优势和应用前景

3.1 流感病毒VLPs疫苗的优势和风险 与鸡胚生产流感病毒相比，BEVS生产抗原有明显优势。在具有大体积生物反应器技术、规模化培养昆虫细胞制备抗原、保证产量的同时，产品质量的稳定性和均一性也得到保障，并且降低了人力成本;禽流感爆发流行会限制原材料鸡胚的供应，使疫苗生产无法供应市场，而细胞放大用于生产，疫苗供应不会中断，并且细胞培养无废物处理环节;不涉及活的流感病毒，无生物安全方面隐患;VLPs自我组装后的宏观结构所展现的是天然的构象决定簇，对于免疫系统而言，可以和活病毒粒子相媲美[25]。

原材料成本方面，鸡胚生产流感病毒使用无特定病原体(SPF)鸡胚做原材料，每枚SPF鸡胚6～8元，抗原产量8～12 mL，还需核算运输成本和孵化损失，最终每毫升抗原折合原材料成本1元左右;市售昆虫细胞培养液价格很高，工业化生产可以直接从培养基生产厂家订购昆虫细胞干粉培养基，10 L装量的干粉培养基价格2000～3000元，最终每毫升抗原折合原材料成本0.2～0.3元。所以与鸡胚生产流感病毒相比，BEVS生产抗原也有价格优势。

利用BEVS研发流感疫苗也有一定技术风险:大体积生物反应器培养昆虫杆状病毒，前期设备投入大，操作维护技术含量高，以高抗原产量为目的的生产工艺摸索也有很大不确定性。

3.2 在人用疫苗的应用前景 欧洲药品审评署(EMEA)和美国食品药物管理局(FDA)先后允许由BEVS生产的人乳头瘤病毒VLPs疫苗在人类使用[26-27]，说明 BEVS生产的疫苗，用于人类是受到认可的。表达流感病毒VLPs的重组杆状病毒的构建技术非常成熟，有很多成功经验。从分离出突变株的结构蛋白基因到疫苗产品一般需十几周时间，疫苗上游研发耗时短，能够应对流感的快速、多突变特性，并且重组昆虫杆状病毒合成后，VLPs的生产过程少于1周时间。纯化质控工艺可以参考现用流感疫苗，通过密度梯度离心和离子交换层析，获得VLPs纯品。纯化的VLPs采用SDS-PAGE光密度扫描法定量，也可以利用粒子构成和血凝分析。

Novavax公司研发的流行性感冒病毒VLPs疫苗正在做一期临床，其三联季节性流感病毒VLPs疫苗已进入二期临床。已公布的结果显示，两种疫苗保证安全性的同时都有较好的免疫原性。

3.3 在兽用疫苗的应用前景 禽流感疫苗在兽用疫苗中占有重要份额，是养禽业疫病防控必不可少的疫苗之一。目前，兽用禽流感疫苗为反向遗传技术构建的疫苗株生产的全病毒灭活疫苗，也是以鸡胚作为生产原料，无需抗原精细提纯，只经过简单浓缩纯化制备的油包水型疫苗。传统鸡胚疫苗经市场多年验证，效果确实。核酸疫苗、活病毒载体疫苗、全病毒细胞苗的研究与开发都在火热进行。兽用流感病毒VLPs疫苗要在激烈的市场竞争中获得认可，前期的研发工作至关重要。

未经纯化的流感病毒VLPs包含有非流感的可溶性蛋白，对致死性攻击也起到100%的保护，不过比纯化的流感病毒VLPs的免疫保护效果差，体现在实验动物短期体重流失[28]。另外，未经纯化的流感病毒VLPs培养液上清内含杆状病毒，不适宜在纯度要求高的人用疫苗使用，在实际应用中，可以考虑将经简单浓缩纯化的流感病毒VLPs用于制备兽用灭活疫苗。目前来看，流感病毒VLPs用于兽用疫苗的相关研究并不是很多。H5N3亚型禽流感病毒VLPs在鸭的研究和H9N2亚型禽流感病毒VLPs在SPF鸡的研究显示，VLPs疫苗在禽类有很好的免疫保护效果，有希望被开发成为新一代禽用疫苗[29-30]。再者，VLPs疫苗不包含核衣壳蛋白(NP)，ELISA检测NP抗体可以区分疫苗免疫动物和自然感染动物，使淘汰扑杀病禽成为可能，有利于养殖场禽流感的净化。

与人用疫苗研发不同，兽用疫苗研发使用本动物做安全性评估和免疫效力评估，评估方法成熟，实验结果认可度高。兽用疫苗特性和动物实验的优势，使得兽用流感病毒VLPs疫苗研发和生产成本远低于人用流感病毒VLPs疫苗。

4 总结

目前，已有多家研究机构和商业公司对BEVS制备的流感病毒VLPs疫苗做了较全面而系统的研究。虽然有各种原理和技术细节有待研究和解决，但此类疫苗仍是备受期待的防控流感的有效疫苗。基于禽流感病毒VLPs兽用疫苗的研究报道甚少，有必要像人用疫苗一样着手重点研究兽用禽流感病毒VLPs疫苗，从而为未来可能出现的禽流感新疫情提早准备对策。

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