动物源多杀性巴氏杆菌耐药性及耐药机制研究进展

孔令聪，战 利，赵 晴，高云航，马红霞，2

(1.吉林农业大学动物科技学院，长春 130118;2.吉林农业大学动物生产及产品质量安全教育部重点实验室，长春 130118)

多杀性巴氏杆菌(Pasteurella multocida，Pm)是引起多种畜禽巴氏杆菌病的病原体，该病以高热、肺炎为主要特征[1]，Pm可以在同种或不同种动物间相互传染，也可感染人。在我国，引起禽和猪巴氏杆菌病的主要病原是荚膜血清A型Pm，引起牛巴氏杆菌病的主要病原是荚膜血清B型Pm。随着病原菌在不同种属动物间的相互感染，血清型也可能随之发生改变。我国的马文戈等[2]首次从病牛组织中分离得到荚膜A型Pm。

动物源Pm不同血清型间的抗原性、宿主嗜性存在着明显的差异，菌间交互免疫效果较差[3]，使其引发的疾病更依赖于抗生素的治疗。随着大量抗菌药物广泛不合理的应用，特别是将抗菌药物作为抗菌生长促进剂以次治疗剂量添加到饲料中，使动物源Pm表现为耐药率高、耐药范围广、呈多重耐药等特点，其直接后果不仅给控制和治疗该病带来困难，而且加剧了抗生素在动物体内的残留，严重危害了动物食品安全[4]。

1 动物源Pm的耐药性研究现状

动物源Pm的耐药，尤其是多重耐药问题已经引起了人们的广泛关注。因而许多国内外的临床工作者积极开展了动物源Pm的耐药性检测研究。

1.1 国外部分地区动物源Pm的耐药性研究Dwight C Hirsh等在美国加州的戴维斯市从临床上分离得到5株鸡源Pm，其中有3株对链霉素耐药，4株对磺胺嘧啶耐药，其耐药株的最小抑菌浓度(minimum inhibitory concentration，MIC)均大于128 μg/mL[5]。Cardenas M 等在西班牙分离到 1 株对喹诺酮敏感的羊源Pm，用逐渐增加抗生素浓度的方法诱导培养，其诱导后的菌株MIC增加了10倍以上[6]。Kehrenberg C等在德国临床分离到牛源Pm，并进行耐药监测，结果显示所分离菌株均对氯霉素和氟苯尼考耐药，其MIC分别为32 μg/mL和16 μg/mL[7]。San Millan A 等从西班牙的首都马德里分离到禽源Pm，发现其对β-内酰胺耐药的菌株都伴随着对四环素、链霉素、磺胺类耐药，且所分离菌株对阿莫西林和磺胺类的MIC已经高达256 μg/mL[8]。

1.2 国内部分地区动物源Pm的耐药性研究 金天明在我国吉林地区分离到禽源Pm，并应用26种抗生素对病原菌进行了药物敏感性试验，结果表明，该菌株对庆大霉素、复方新诺明、头孢氨苄、头孢唑啉、四环素、依诺沙星等21种抗生素产生耐药性[9]。Tang X等在中国部分地区分离得到233株猪源Pm，并对20种临床常用药物做了药敏试验，结果显示，70%的菌株对阿莫西林、林可霉素、磺胺二嘧啶、新诺明呈高度耐药;20%的菌株对大观霉素、卡那霉素、新霉素、庆大霉素、替米考星耐药，其对阿莫西林、大观霉素、替米考星、氯四环素、盐酸环丙沙星的MIC已达128 μg/mL[10]。吉林农业大学动物科技学院实验室自2010年以来从我国吉林、内蒙古、湖北、河北等省份分离得到牛源多杀性巴氏杆菌12株，分离菌株的耐药性检测结果显示，所有菌株都对新诺明和链霉素高度耐药，其MIC均大于256 μg/mL，从吉林和湖北分离得到的菌株对临床治疗常用的喹诺酮类和大环内酯类抗生素亦产生了耐药性，其MIC均为64 μg/mL。

从以上文献可知，不同国家和地区分离的动物源Pm，对常用的各种抗生素均显示出不同程度的耐药性，且兽医临床使用频率较高的抗生素产生的耐药性较高。动物源Pm的耐药性存在着一定的地域差异性，这可能跟不同国家和地区在动物治疗中所使用或在饲料中添加的抗生素的种类以及使用方法、对药物的用量标准不同有关，从而造成了不同国家和地区动物源Pm的耐药性有所差异。

2 动物源Pm的耐药机制

目前，国内外学者研究发现动物源多杀性巴氏杆菌的耐药可能与耐药质粒、耐药基因的突变、外排泵的过量表达、整合子介导等因素有关。

2.1 质粒介导的动物源Pm的耐药 根据目前的研究结果，动物源Pm的耐药主要由质粒介导，其质粒携带的耐药基因在细菌间穿梭，使其不断产生耐药性。Corinna等[11]报道，从临床分离的牛源 Pm耐药株存在10.8 kb的耐药质粒(Pcck381)，通过限制性内切酶酶切、克隆和序列分析发现该质粒只介导氟苯尼考和氯霉素耐药，其与3.2 kb的大肠杆菌耐药质粒(Pmbsf1)有很高的同源性，该质粒的耐药性是由floR基因所介导的，且该基因与先前报道的floR基因同源性高达99.7%。

Corinna等[12]通过PCR和转化对从德国分离的耐氟苯尼考的2株猪源Pm和1株牛源Pm进行耐药机制分析，结果发现其中2株含有耐药质粒(Pcck381)，1株含有携带 floR基因的质粒(Pcck1900)，floR基因存在于链霉素耐药基因strA和strB的下游，其所介导的氟苯尼考的耐药性与2005年报道的英国耐药株耐药性相同，通过脉冲电泳分析，其所介导的氟苯尼考的耐药表型取决于质粒的水平转移，而不是病原菌的传播。

2.2 基因突变介导的动物源Pm的耐药 抗菌药物作用位点的改变或新作用位点的产生可能是细菌对某一类具有相同或相似结构抗菌药物耐药的最主要因素。Cardenas M等在西班牙分离到1株对喹诺酮敏感的羊源Pm，用逐渐增加抗生素浓度的方法诱导培养，其诱导后的菌株MIC增加了10倍以上，通过PCR扩增诱导前后菌株的gyrA基因，发现其喹诺酮耐药决定区(QRDR)第83位氨基酸由丝氨酸突变成了异亮氨酸[6]，其符合QRDR区单点突变规律[13]，但其他源多杀性巴氏杆菌对喹诺酮类耐药是否也与QRDR区的位点突变有关，有待于进一步研究。

金天明等[9]通过PCR分别扩增禽源Pm敏感株和耐药株的链霉素耐药基因StrA和磺胺耐药基因SulⅡ，经过克隆和核苷酸序列测定，结果表明，耐药株Pm对链霉素和磺胺耐药性的差异与StrA和SulⅡ基因突变有关(耐药性较高的菌株，其突变频率较高)，且试验中所有耐药株均为StrA基因编码的第204位氨基酸处发生突变，在SulⅡ基因编码的第159、246、384、584、590、591、597、582 位氨基酸处存在突变，这些基因的突变可能是导致Pm对链霉素和磺胺类产生耐药的主要因素。

2.3 外排泵介导的动物源Pm的耐药 药物外排泵(主动外排系统)是能将有害底物排出菌体外的一组转运蛋白，其过量表达可引起细菌对抗生素耐药。随着人们对细菌细胞膜上的外排泵介导耐药研究的深入，多杀性巴氏杆菌的耐药尤其是多重耐药的研究进入了更深的层次，然而药物主动外排机制在动物源Pm中的作用还未得以充分阐明。

目前，少数文献报道动物源Pm对四环素的耐药主要是Tet蛋白的表达导致细菌药物外排系统的产生，进而使Pm对四环素以及类似药物产生耐药性，其机制与枯草芽孢杆菌的bmr基因编码的外排蛋白Bmr极为相似[14]。Corinna等对耐四环素的猪源Pm进行PCR扩增耐药基因和杂交实验，结果发现，在24株Pm中，有2株在染色体DNA上检测到tet(H)基因，但是只有1株携带两个拷贝的tet(B)基因，它是进入细菌的决定基因，其耐药性由此基因决定[15]。Kehrenberg C等首次在牛源 Pm中发现了编码膜外排蛋白点的tet(L)基因，该基因存在于质粒Pcck3259中，其与携带tet(B)基因的质粒 Pcck647 极为相似[16]。

Tamas Hatfaludi等在禽源 Pm中发现了pm0527和pm1980两种蛋白，其与细菌的Acra-Tolc主动外排系统的Tolc很相似，通过系统发育树分析，其都属于TolC成员，并确定其与主动外排系统有关。但是否与AcrAB-tolC一样，其高水平的表达能表现出对化合物耐受，以及其外排底物包括四环素类、氯霉素、红霉素和氟喹诺酮类，还需要进一步的研究[17]。

2.4 整合子(基因盒系统)介导的动物源Pm的耐药 整合子介导的细菌耐药机制，因其能解析耐药基因的高效快速传播而受到高度关注[18-19]。目前在革兰阴性菌中已经研究的整合子有四类，每一类都含有不同的int基因，Ⅰ类整合子较为普遍，它可以携带多个耐药基因，可编码产生对氨基糖苷类、氯霉素类、大环内酯类、磺胺类耐药。

Corinna Kehrenberg 等[15]从临床分离的耐大观霉素和链霉素的牛源多杀性巴氏杆菌中发现了一类整合子的aadA14基因，该基因存在于质粒PCCK647中，将该质粒电转化到JM109感受态细胞中，结果使其对大观霉素和链霉素都产生了耐药性，其MIC值分别为512 μg/mL和25 μg/mL。通过系统发育树比对，该基因与其他细菌的aadA14的同源性相距甚远，其最近的同源簇也只能达到57%，但在德国分离的4株耐大观霉素的牛源Pm耐药株中却没有发现aadA14基因。该基因是否是通过携带基因盒的整合子插入到该质粒上，以及插入基因盒的类型和顺序并没有得到进一步的阐明[11]。

Kristina Kadlec等[20]对临床分离的多重耐药的牛源Pm进行完整基因组测序，并首次发现了其菌体基因组上存在对大环内酯类产生抗性的基因，分别是rRNA甲基化酶基因erm(42)、大环内酯转运基因msr(E)、大环内酯磷酸转移酶mph(E)。大多革兰阴性菌可以产生染色体介导酶和质粒介导酶，例如头孢菌素酶、广谱酶，但在多杀性巴氏杆菌中还没有类似的报道。

总之，动物源Pm的耐药机制日益被人们所重视，探讨动物源Pm多重耐药性的产生及其传播机制，从而为有效地控制耐药基因的传递和表达，建立快速诊断细菌耐药性方法，以及为指导新药的研发奠定理论和实践基础。耐药尤其是多种治疗药物共同作用下，由基因突变、质粒介导、整合子介导和主动外排所表现出的多重耐药性及其耐药机制将是今后的研究热点。

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