基因芯片技术应用于动物传染病诊断的研究进展

郝菊秋

（辽宁职业学院，辽宁 铁岭 112000）

1996年，美国Affvmetrix生物公司制造出世界上第一块商业化的基因芯片，由此掀起了基因芯片研究热潮。基因芯片技术是一项将生命学科与微电子学、化学和计算机科学等集于一体的高度交叉的尖端应用型技术，现已在药物筛选、药物开发、基因诊断、基因突变、基因表达分析、多态性分析和环境科学等多个领域显示出巨大的理论意义和应用价值［1］，基因芯片的诞生，不但为兽医科学的发展和科学研究提供了有用手段，而且为动物疾病的诊断和防治提供了新的方法。本文就基因芯片应用于动物传染病诊断的研究进展作一介绍。

1 基因芯片技术概述

基因芯片，又称DNA芯片（DNA chips），属于生物芯片中的一种，是综合微电子学、物理学、化学及生物学等高新技术，把大量DNA探针或基因片段按特定的排列方式固定在硅片、玻璃、塑料或尼龙膜等载体上，形成的致密、有序的DNA分子点阵，因固相载体常用硅玻片或硅芯片，故称之为基因芯片。基因芯片技术的基本原理是分子生物学中的核酸分子原位杂交技术：将短链核酸分子固定在固相载体上作为探针，待分析样品经过标记后与固定在芯片上的探针杂交。基因芯片技术的分类方法很多［2］，最常用的是按载体上所点探针的长度分为cDNA芯片和寡核苷酸芯片。根据芯片的功能可以分为基因表达谱芯片和DNA测序芯片；根据载体也可分为液相芯片、固相芯片。无论哪种芯片，其技术流程主要包括芯片的制备、待测样本的制备和标记、杂交反应、结果检测和数据处理分析等。与传统的核酸印迹杂交技术相比，基因芯片具有可信度高、信息量大、操作简单、重复性强以及可以反复利用等诸多优点。

2 基因芯片技术在动物传染病诊断中的应用

2.1 cDNA诊断芯片 猪传染病中，多种病原体混合感染极其常见，检测其病原微生物就显得尤为重要。张焕容等［3］制备伪狂犬病病毒（PRV）、猪细小病毒（PPV）和流行性乙型脑炎病毒（JEV）检测基因芯片。选定靶基因最佳点样质量浓度为200mg／L，用基因芯片点样仪将其点制在氨基化基片上。结果表明，探针最佳使用质量浓度为3000μg／L，芯片系统检测灵敏度可达3μg／L。郭瑶等［4］采用连接酶检测反应（LDR）-PCR和基因芯片技术，检测和鉴别猪圆环病毒2型（PCV-2）、猪细小病毒（PPV）和伪狂犬病病毒（PRV）在3种病毒的保守区内分别设计一对LDR探针，两端各连接一段通用序列，依次进行LDR、通用引物荧光标记扩增和芯片杂交，同时比较引物标记和Cy5-dCTP标记方法的灵敏度。利用建立的方法对41例临床样品进行检测，与普通PCR检测结果符合率为97.6%～100%。表明该方法可以特异地检测PCV2、PPV和PRV 3种病毒。

cDNA诊断芯片的研制应用于禽和马的一些常见传染病中。田丽娜等［5］将克隆和鉴定的AIV的HA、NA、M、NS、NP基因以及 NDV、IBDV、IBV的保守基因片段作为探针，同时以克隆的GAPDH基因作为阳性对照，利用芯片点样系统SpotArray-TM24将探针与阳性对照、阴性对照和空白对照按照设计好的阵列点在基片上，制备了AIV等RNA病毒诊断芯片，该方法对20份已鉴定的H5N1亚型禽流感病毒的检出率为100%（20／20）；10份现地送检的疑似AIV样品的检出率为70%（7／10），检测结果与RT-PCR和鸡胚传代分离鉴定的符合率为100%。结果表明，制备的DNA芯片可有效诊断禽流感病毒。汪琳等［6］采用人工拼接的方式拼接了非洲马瘟病毒核酸序列、通过分子克隆技术获得西尼罗热、马冠状病毒、马鼻肺炎病毒和马动脉炎病毒的特异基因片段，设计合成5种马病病毒高度保守的特异性核酸序列作为检测探针点制于芯片上，再用多重不对称PCR以拼接、克隆的核酸序列为模板扩增目的片段，与芯片上探针特异结合。本基因芯片检测方法可应用于大规模出入境马属动物的快速筛查。

2.2 寡核苷酸诊断芯片 寡聚核苷酸芯片序列选择经过优化，利用合成的一定长度的寡核苷酸单链探针代替全长cDNA点样，制成芯片。狂犬病是狂犬病病毒引起的一种急性中枢神经系统人兽共患病。张伟等［7］根据已发表的狂犬病病毒（RV）的序列，设计合成能扩增高度保守核（N）蛋白片段的一对引物。通过生物素标记PCR技术，将核（N）蛋白基因片段作为探针点在硝酸素纤维膜上，制作成疾病诊断基因芯片。取160份可疑动物的血液，提取核酸作模板进行PCR扩增，将其产物与诊断基因芯片进行特异性逆向点杂交检测；并用蔗糖密度梯度离心和凝胶层析纯化狂犬病病毒作抗原，建立检测RV抗体的间接ELISA。把以上两种方法应用于临床，结果基因芯片的检测率比ELISA方法和（RT）PCR要高15%左右。

姜永厚等［8］建立一种可同时检测区分猪瘟病毒（CSFV），猪繁殖与呼吸障碍综合征病毒（PRRSV）和猪圆环病毒2型（PCV-2）的寡核苷酸基因芯片方法，本研究针对每种病毒设计了4条～6条寡核苷酸探针。利用建立的寡核苷酸基因芯片方法对76个仔猪样本进行了检测，其中25个样本（32.9%）同时感染了2种以上病毒。郭焕成等［9］建立高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒Nsp2缺失变异株与经典美洲型毒株基因芯片鉴别方法。设计扩增美洲型PRRSV保守序列和包含基因缺失区域的Nsp2基因片段的二重PCR引物，并设计长度为31～35nt的美洲型毒株通用寡核苷酸探针和非缺失株相对于变异株Nsp2基因缺失区域的探针。建立的寡核苷酸芯片方法能够准确鉴别高致病性PRRSV Nsp2缺失变异株。杨林等［10］根据猪流感病毒（SIV）的M基因序列设计了1对特异性引物M1／M2，扩增出大小为229bp的目的片段。针对这个基因片段，再设计合成4条寡核苷酸探针，其中反向引物的5′端用荧光素Cy3标记。以荧光标记不对称PCR技术为基础，通过将单链PCR产物与芯片杂交实现对SIV的检测。利用该方法对39份猪组织样品进行检测，本方法具有良好的特异性和敏感性。

韩雪清等［11］根据GenBank上已发表的禽流感病毒不同亚型的基因序列，设计合成了25对特异性引物和1对通用引物，然后以各亚型病毒的参考株RNA作为模板，建立扩增不同亚型的多重RTPCR方法。参考各亚型病毒靶cDNAs区域的保守序列设计了52条亚型特异的探针。在此基础上，将设计好的探针点制到处理好的玻片上，制备了禽流感病毒分型鉴定基因芯片，结合所建立的扩增不同亚型的多重RT-PCR方法，开发了禽流感病毒亚型鉴定基因芯片试剂。利用收集自49个地区的2653份标本对其特异性和敏感性进行了初步评价。证明该病毒分型基因芯片具有良好的特异性、敏感性。

3 结论及展望

基因芯片技术在诸多领域已呈现出广阔的应用前景和商业前景，已引起世界各国的广泛关注。目前，基因芯片技术在医学、分子生物学领域应用越来越广泛，受到人们的普遍重视；随着芯片技术的不断研究和应用，很多问题正在逐步解决，人医已有10余个应用芯片技术开发的检测试剂盒被政府批准使用。随着基因芯片技术不断发展完善，基因芯片将会成为一种更快速、准确和简便的动物传染病检测技术。在不久的将来，基因芯片技术将为动物传染病的诊断提供一个重要的研究和应用平台。

［1］宋振强，王江辉，薛双，等.基因芯片在动物医学中的应用进展［J］.郑州牧业工程高等专科学校学报，2006，26（2）：21-22.

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［3］张焕容，曹三杰，文心田，等.伪狂犬病病毒、猪细小病毒和流行性乙型脑炎病毒检测基因芯片的制备［J］.中国兽医学报，2007，27（5）：667-670.

［4］郭 瑶，汪 平，董沁芳，等.同时检测猪圆环病毒2型、猪细小病毒和伪狂犬病病毒连接酶检测反应-PCR基因芯片检测方法的建立［J］.中国预防兽医学报，2011，33（7），526-530.

［5］田丽娜，王秀荣，杨忠苹，等.禽流感病毒等RNA病毒鉴别基因芯片的制备［J］.中国兽医科学，2008，38（08）：685-690.

［6］汪琳，周琦，柏亚铎，等.五种马病毒基因芯片检测方法的建立［J］.检验检疫学刊，2011，21（3）：38-41.

［7］张 伟，吴时友，尹燕博，等.狂犬病诊断基因芯片的建立和检测应用的初步研究［J］.中国预防兽医学报，2008，30（2）：132-135.

［8］姜永厚，商晗武，徐 辉，等.基于多重PCR的寡核苷酸基因芯片检测猪瘟病毒，猪繁殖与呼吸障碍综合征病毒及猪圆环病毒1型和2型［J］.中国预防兽医学报，2010，32（3）：194-199.

［9］郭焕成，席进，李江南，等.高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒Nsp2缺失变异株与经典美洲型毒株基因芯片鉴别方法的建立［J］.中国生物制品学杂志，2010，32（11）：1254-1259.

［10］杨 林，马世春，苏增华，等.猪流感病毒基因芯片检测技术的研究［J］.中国兽医杂志，2008，44（7）：3-5.

［11］韩雪清，林祥梅，侯义宏，等.禽流感病毒分型基因芯片的研制［J］.微生物学报，2008，48（9）：1241-1249.