缺血后处理对短暂性脑缺血后蛋白质氧化损伤的影响

孟繁凯 李再雨 徐 宁 杨福伟 李光民 罗毅男 葛鹏飞

(吉林省人民医院神经外科，吉林 长春 130021)

缺血后处理(ischemic postconditioning)是在脑缺血结束后再灌注开始时对再灌注进行一系列指定的有规则的机械性的终止，然后才给予脑组织充分的再灌注。最近研究表明缺血后处理也能对抗神经组织的缺血再灌注损伤，减小大鼠脑梗死的体积〔1〕，改善兔脊髓缺血损伤后运动功能〔2〕。而且，缺血后处理能在缺血后实施，然而缺血后处理脑保护作用的机制尚不清楚。因此本文从脑缺血应激性后蛋白质损伤的角度探讨了缺血后处理脑保护作用的机制。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物及分组 雄性Wistar大鼠，280～320 g，52只，由吉林大学实验动物部提供。随机分为假手术组，缺血组(阻断大脑中动脉2 h，再恢复血流24 h)，后处理组(阻断大脑中动脉2 h后，进行后处理，然后再恢复血流24 h)，每组14只。其中6只用于红四氮唑(TTC)染色光镜观察，8只用于分析过氧化氢及蛋白质氧化产物羰基化合物的含量。

1.1.2 实验试剂与设备 试剂均购自Sigma公司。光学显微镜为日本产Olympus BX-51型。切片机为德国产Leica VT型，蛋白质定量试剂盒购自Bio-Rad公司。

1.2 方法

1.2.1 模型制备 采用大脑中动脉闭塞法(MCAO)建立局灶脑缺血再灌注模型。大鼠禁食一夜，随便饮水。苯巴比妥钠腹腔麻醉(300 mg/kg)。采用颈部正中直线切口，长约3 cm，暴露右侧颈总动脉、颈内动脉及颈外动脉。结扎颈外动脉近侧端;用血管夹暂时夹闭颈总动脉，在夹闭远端剪一口，向颈内动脉插入制备好的鱼线，插入大约19～22 mm，堵塞大脑中动脉及大脑前动脉的分叉部，缺血2 h。手术过程中大鼠体温维持在(37±0.5)℃。对照组仅分离血管，不进行线栓。动物麻醉清醒后，按5分制评分标准进行评分。0分:无神经系统症状;1分:不能完全伸展对侧前爪;2分:爬行时转圈;3分:向对侧倾倒;4分:不能自行行走，意识丧失;1～3分的动物入选。

1.2.2 缺血后处理方法 缺血结束后，缺血组的线拴直接拔出;后处理组的线拴后撤5 mm，30 s后再插到大脑中动脉与大脑前动脉分叉处，堵塞30 s后再后撤5 mm。反复3个周期。

1.2.3 计算梗死脑体积 再灌注24 h后，每组至少有4只大鼠通过过量麻醉被处死。梗死脑组织体积的计算采用TTC染色法。正常组织染为红色，梗死组织染为白色，再用10% 甲醛固定后照相。利用图像分析仪测定每个脑片的梗死面积。以梗死脑组织体积占整个脑组织体积的百分比代表损伤程度。

1.2.4 匀浆及亚细胞结构的分离 大鼠过量麻醉后，立即用100 ml冰磷酸盐缓冲液(PBS)液(0.1 mol/L，pH7.4)经心脏灌注脑组织，然后取脑组织，剥离背外侧的新皮层脑组织，用Dounce匀浆器按照重量体积比1∶10加入匀浆缓冲液后抽压20次进行匀浆。匀浆缓冲液(pH7.4)含有210 mmol/L甘露醇，20 nmol/L蔗糖，5 mmol/L Hepes，1 mmol/L乙二胺四乙酸(EDTA)。以1 000 r/min离心10 min去除细胞核及碎片，取上清以10 000 r/min离心10 min后将沉淀物用不含EDTA的匀浆缓冲液重悬。再次以1 000 r/min离心10 min，所得沉淀即含有线粒体。再将沉淀用不含EDTA的匀浆缓冲液重悬，用Bio-Rad蛋白质定量试剂盒测定蛋白浓度。

1.2.5 荧光测定法检测线粒体内过氧化氢的含量 参照文献〔3〕，1 ml反应物包含 5 mmol/L磷酸盐缓冲液(pH7.4)，150μg线粒体蛋白，2 mmol/L p-羟基乙酸苯酯，16 U的辣根过氧化物酶，3 mmol/L氯化镁和2 mmol/L叠氮华钠。加入2 mmol/L的氰化钾(溶于0.1 mol/L的碳酸钠溶液)，37℃孵育30 min，采用荧光法检测过氧化氢的释放量(激发光波长为318 nm，吸收光波长为405 nm)。

1.2.6 分光光度计法检测蛋白质氧化产物羰基化合物含量参照文献〔3〕，将10 mmol二硝基苯肼(溶于2.5 mol/L盐酸溶液)加入匀浆缓冲液，室温条件下避光孵育60 min。震荡混匀后，加入20%的三氯乙酸，再用1∶1的乙醇醋酸混合物洗3遍。沉淀的蛋白质重悬在pH6.5的20 mmol/L PBS(含6 mol/L盐酸胍)。离心除去不溶物，检测上清的光吸收值(370 nm)。采用湮灭系数22 000 M/cm计算蛋白糖基化产物含量。

1.3 统计学处理 应用STATA7.0统计软件，所有计量数据以x±s表示。

2 结果

2.1 脑梗死体积的变化 采用梗死脑组织与整个脑组织的比值来代表脑组织的损伤情况。在缺血组，梗死脑组织的体积大约占整个脑组织体积的(37.91±2.16)%;缺血后处理使梗死脑组织的体积显著下降，大约占整个脑组织的(21.38±1.65)%，组间比较差异显著(P＜0.01)。

2.2 过氧化氢的变化 过氧化氢是氧化应激反应过程中形成的一个重要的氧自由基，因此检测缺血后处理对脑组织中过氧化氢含量的影响。缺血组中过氧化氢的生成量是(1.24±0.22)mmol·mg－1蛋白·min－1;缺血再灌注处理后，下降为(0.84 ±0.17)mmol·mg－1蛋白·min－1(P ＜0.01)。假手术组过氧化氢含量为(0.45 ±0.08)mmol·mg－1蛋白·min－1。

2.3 蛋白质羰基化产物的变化 假手术组中，羰基化合物的含量为(9.42±1.21)mmol/mg蛋白;缺血组中羰基化合物含量(15.61±1.92)mmol/mg，缺血后处理使其含量显著下降到(11.71±1.37)mmol/mg蛋白(P＜0.01)。

3 讨论

脑缺血再灌注后氧化应激反应被认为是导致脑损伤的一个主要因素〔4〕。已有研究表明，缺血再灌注过程中所产生的氧自由基可以导致神经元内的核酸、脂类等大分子的损伤，进而引发一系列的级联反应，最后导致神经元的凋亡〔5〕。虽然氧自由基对脑缺血再灌注后蛋白质损伤尚未见报道，但以往研究表明氧化应激性蛋白质损伤是导致细胞内形成有细胞毒性的蛋白聚集物的重要原因〔6〕。在本文中，采用大鼠局灶性脑缺血模型证实在脑缺血再灌注过程24 h后损伤脑组织中的过氧化氢含量显著增加，同时能够反映蛋白质氧化应激损伤的羰基化合物的含量在损伤脑组织中也显著增加，这说明在脑缺血再灌注过程中存在氧化应激性蛋白质损伤。

虽然以往对缺血后处理的脑保护作用机制进行较多的研究，发现缺血后处理能够抑制凋亡作用〔7〕，阻断导致神经元凋亡的信号通路〔8〕，还能抑制氧化应激反应，减少氧化应激性脂质损伤〔7〕。但是，缺血后处理对脑缺血再灌注后受损脑区内蛋白质的影响尚不清楚。在本文中，发现缺血后处理不仅能够减少局灶性脑出血再灌注导致的脑组织损伤，使损伤脑组织体积由(37.91±2.16)%降低到(21.38±1.65)%，同时还减少了氧自由基之一过氧化氢的含量及氧化应激性蛋白质损伤的产物羰基化合物的含量。因此，缺血后处理具有保护局灶脑缺血再灌注后脑组织损伤的作用，这种保护作用与氧化应激性蛋白质损伤减少有密切关系。

氧化应激性蛋白质损伤减少一方面与氧化应激反应降低有关，这在本文中已经得到验证;另一方面与损伤蛋白质的降解有关系。目前研究认为，蛋白质氧化产物即带有羰基的化合物需要经过泛素蛋白质途径降解〔9〕。本研究没有采用蛋白酶体特异性底物在体外检测损伤脑区中蛋白酶体的活性变化，但是根据以往的研究结果推测在局灶脑缺血再灌注过程中蛋白酶体活性也会显著下降。所以，蛋白酶体活性下降使得细胞内因氧化应激反应受损的蛋白质不能被降解，进而彼此粘连在一起形成具有细胞毒作用的蛋白聚集物，导致神经元死亡。

本研究不仅进一步证实了缺血后处理具有显著的脑保护作用，而且发现蛋白质损伤在缺血再灌注后神经元损伤中具有重要的作用。还发现缺血后处理的脑保护作用与其能够降低缺血再灌注后的氧化应激反应以及减少氧化应激性蛋白质损伤有密切的关系，这为缺血后处理进一步应用到临床实际工作中提供了理论支持。

1 Xing B，Chen H，Zhang M，et al.Ischemic postconditioning inhibits apoptosis after focal cerebral ischemia/reperfusion injury in the rat〔J〕.Stroke，2008;39(8):2362-9.

2 Jiang X，Ai C，Shi E，et al.Neuroprotection against spinal cord ischemiareperfusion injury induced by different ischemic postconditioning methods:roles of phosphatidylinositol 3-kinase-Akt and extracellular signalregulated kinase〔J〕.Anesthesiology，2009;111(6):1197-205.

3 Jolitha AB，Subramanyam MV，Asha-Devi S.Modification by vitamin E and exercise of oxidative stress in regions of aging rat brain:studies on superoxide dismutase isoenzymes and protein oxidation status〔J〕.Exp Gerontol，2006;41(8):753-63.

4 Chen SD，Yang DI，Lin TK，et al.Roles of oxidative stress，apoptosis，PGC-1α and mitochondrial biogenesis in cerebral ischemia〔J〕.Int JMol Sci，2011;12(10):7199-215.

5 Sugawara T，Chan PH.Reactive oxygen radicals and pathogenesis of neuronal death after cerebral ischemia〔J〕.Antioxid Redox Signal，2003;5(5):597-607.

6 Norris EH，Giasson BI.Role of oxidative damage in protein aggregation associated with Parkinson's disease and related disorders〔J〕.Antioxid Redox Signal，2005;7(5-6):672-84.

7 Yuan Y，Guo Q，Ye Z，et al.Ischemic postconditioning protects brain from ischemia/reperfusion injury by attenuating endoplasmic reticulum stressinduced apoptosis through PI3K-Akt pathway〔J〕.Brain Res，2011;1367:85-93.

8 Jung T，Grune T.The proteasome and its role in the degradation of oxidized proteins〔J〕.IUBMB Life，2008;60(11):743-52.

9 Ge P，Luo Y，Liu C，et al.Protein aggregation and proteasome dysfunction after brain ischemia〔J〕.Stroke，2007;38(12):3230-6.