磷酸二酯酶4D SNP与缺血性脑卒中的相关性

曾宪思 白 洁 (昆明理工大学生命科学与技术学院，云南 昆明 650224)

磷酸二酯酶(PDEs)是一个多基因家族。PDEs催化环腺苷酸(cAMP)和环鸟苷酸(cGMP)分别生成AMP和GMP，这是细胞内降解cAMP和cGMP的唯一途径。PDEs可以分为11个家族，分别为1～11，其中PDE4能特异性地水解cAMP。PDE4又可以分为A、B、C和D 4个亚家族。关于PDE4D基因与缺血性脑卒中相关性的研究结果不一致。本文将就PDE4D和缺血性脑卒中的研究进展做一综述。

1 PDE4D基因、蛋白结构及其功能

1.1 PDE4D基因 PDEs由20个基因组成，根据氨基酸序列同源性、酶作用底物特异性和药理学性质将它们分成11个家族。11个PDEs的任一个都包括1～4个不同的基因〔1〕。PDE4有A、B、C、D四个亚家族。PDE4D基因在人类染色体中定位于5q12，大小约为1.6 Mb，包含24 个外显子〔2〕。

1.2 PDE4D蛋白结构 PDE4D基因通过使用多个启动子和选择性拼接编码若干个功能蛋白亚型，分别为PDE4D1～9。这些蛋白的催化区和C－端是一致的，N－端差异较大。根据N－端是否含有上游保守序列(UCR)可以将它们分成长式结构、短式结构和超短式结构。长式结构包含上游保守序列1和2(UCR1和UCR2)，短式结构缺少UCR1，超短式结构缺少UCR1和部分UCR2。UCR1和UCR2分别含有60和80个氨基酸残基，它们由连接区1(LR1)连接，LR1长度大约为24个氨基酸残基，UCR2通过LR2与催化区相连，LR2大小为10～28个氨基酸。在人类中长式结构有PDE4D3～5蛋白和PDE4D7～9，短式结构只有 PDE4D1，超短式结构有 PDE4D2 和 PDE4D6〔1，3〕。

1.3 PDE4D的功能 PDE4在体内广泛表达，主要分布于各种炎性细胞内，包括肥大细胞、巨噬细胞、嗜酸粒细胞、淋巴细胞和上皮细胞等。cAMP和cGMP是细胞内的第二信使，它们在神经传递、肌肉收缩、免疫反应、细胞生长和分化、代谢、视觉、嗅觉、记忆、胞吐作用等生理过程中起重要作用。而细胞内cAMP和cGMP的合成和降解都要受到严格的调控:腺苷酸环化酶(AC)和鸟苷酸环化酶(GC)分别将ATP和GTP转变为相应的环化结构形式，而PDEs催化cAMP和cGMP水解，开环，分别生成非活性形式的5′AMP和5′GMP。这是细胞内降解cAMP和cGMP的惟一途径。在11个PDEs家族中有8个能降解cAMP，PDE4能特异性降解cAMP。有证据表明cAMP信号是区域化的〔4〕。PDE4在不同时间调节cAMP浓度改变，所引起的cAMP介导的信号途径不同。在正常细胞中PDE4D占PDE4活性的60% ～70%，而在炎症细胞中 PDE4D至少占PDE4活性的80%。PDE4D对炎症、血小板稳定性、损伤应答、血管生成的影响不同，在脑卒中发生发展过程中起不同的作用。deCODE研究组和其他的研究者证实，PDE4通过各亚型的相对表达量来调节PDE4D活性。PDE4D在其表达的组织中调节生物活性中扮演着复杂的角色〔5〕。

1.4 PDE4D的短期调节

1.4.1 UCR1和UCR2以及催化区的作用 PDEs的N－端具有调节功能，UCR1和UCR2对PDEs的活性具有重要的调节作用。UCR1疏水的C－端与UCR2亲水的N－端相互作用，UCR1/2又与PDE4D催化区相作用，从而调节PDE4D活性。UCR1和UCR2介导cAMP－依赖蛋白激酶(PKA)和细胞外信号调节激酶2(ERK2)磷酸化。PKA可以将UCR1中特定位点的丝氨酸残基磷酸化，进而提高了长式PDE4D活性。而丝氨酸残基在整个家族中极其保守，对酶活性的维持起重要作用。PKA磷酸化破坏了处于低活性状态的离子对及UCR1与UCR2的相互作用，导致其构象改变，激活长式PDE4D。ERK可以将催化区丝氨酸残基磷酸化，进而导致PDE4D活性降低。这种抑制作用是暂时的:当细胞外的刺激作用于细胞膜后，产生一系列信号。cAMP是信号传导途径中的重要信使，当细胞外信号分子(配体)与G蛋白耦联受体(GPCRs)结合后激活AC，细胞内cAMP水平迅速升高，PKA被激活并将UCR1中的丝氨酸残基磷酸化，从而消除ERK的抑制作用。短式PDE4D缺少UCR1，却反而被ERK的磷酸化活化，可能有其他调节成分参与。此外，ERK对超短式PDE4D活性没有影响〔6〕。

1.4.2 PDE4D信号复合物 PDE4D能和某些蛋白如抑制蛋白(arrestin)结合而定位于细胞特定的区域内。PDE4D及其锚定蛋白在细胞内选择性地表达来调控cAMP信号。Arrestin是信号支架蛋白，在许多GPCRs脱敏过程中起重要作用。目前已知 arrestin 有4 个成员:β－arrestin1、β－arrestin2 和两个视觉 arrestin。PDE4D通过它们保守的催化区与β－arrestin形成稳定的信号复合物。β肾上腺素受体(βAR)，βAR有两种亚型:β1－AR和β2－AR。βAR与胞外信号结合后会产生两条不同的信号通路:首先都是Gs介导的cAMP信号通路，Gs激活AC随之产生cAMP。然后PKA使βAR磷酸化，β1－AR与PDE4D8形成信号复合物 β1－AR/PDE4D8，而 β2－AR 要与 β－arrestin 结合后才能与 PDE4D5 形成信号复合物 β2－AR/β－arrestin/PDE4D5〔1〕。另外，在恐惧条件下，β－arrestin－2会转移到杏仁核胞膜处与PDE4D结合成β－arrestin－2/PDE4D复合物，进而抑制了PKA的活性〔7〕。

2 咯利普兰

咯利普兰(roliplam)是1976年鉴定的第一个PDE4抑制剂，也是迄今为止最为常用的经典PDE4抑制剂〔8〕。咯利普兰是一种选择性的PDE4抑制剂，能够特异性抑制PDE4的活性，增加细胞内的cAMP水平，进而激活多种蛋白磷酸化途径，对中枢神经功能、心血管功能、炎症细胞/免疫系统、细胞黏附以及代谢过程都有影响。用咯利普兰的短时(2 min)预处理引起人脐静脉内皮细胞(HUVEC)cAMP的上升，然而长时(8 h)预处理会引起HUVEC cAMP的下降。用咯利普兰长时预处理诱导PDE4活性明显增加。这一结果表明咯利普兰对PDE4的抑制能诱导PDE4活性的增加，这可能作为促进cAMP降解的代偿机制〔9〕。咯利普兰是作用于细胞内靶点的新型抗炎药物，但是PDE3和PDE5的抑制剂的共同处理能降低咯利普兰的抗炎症效应〔10〕。咯利普兰能抑制相关炎症细胞的招募和激活，抑制由脂多糖(LPS)引起的炎症因子的产生。咯利普兰能增加大鼠细胞质胰高血糖素样肽1(GLP－1)的浓度，并且能够增强葡萄糖诱导的 GLP－1 的释放〔11〕。

3 缺血性脑卒中

脑卒中是神经系统常见病和多发病，死亡率约占所有疾病的10%，是世界范围内的死亡和长期致残的三大原因之一〔12，13〕。脑卒中是痴呆和年龄相关的认知下降的重要原因，还是晚发癫痫症的主要原因〔14〕。大约50% ～70%的存活者遗留瘫痪、失语等严重残疾。脑卒中包括缺血性脑卒中、出血性脑卒中、高血压脑病和血管性痴呆，其中大约80%的脑卒中源于缺血性，大多数由动脉硬化症引起〔15〕。根据TOAST(the Trial of Org 10172 in Acute Stroke Treatment)标准，缺血性脑卒中可以再细分成3个主要的种类:(1)大动脉硬化症，(2)心源性梗死，(3)梗死引起的小脉管闭塞〔12〕。环境和遗传因素都有能引起缺血性脑卒中的危险，一直以来，糖尿病、高血压、心肌梗死以及抽烟史等被认为是脑卒中的经典危险因素。然而，这些环境危险因素的控制并没有降低脑卒中的发病率〔16〕，是由于对这种疾病的易患病的体质的遗传基础知之甚少〔17〕。

4 PDE4D与缺血性脑卒中

2003年，冰岛的 Gretarsdottir等〔18〕deCODE研究组成员发现，PDE4D基因的多态性增加了缺血性脑卒中的危险性。他们在冰岛人群中发现了与家族性缺血性脑血管病(ICVD)相关的基因:PDE4D基因与脑动脉粥样硬化的发生、发展有关。该基因和以往认识的与高血压、糖尿病、血脂代谢异常、高胆固醇血症等脑血管病危险因素的相关基因不同，被认为是21世纪首先、也是迄今唯一新发现的脑卒中候选基因〔12，19〕。他们发现PDE4D 单核苷酸多态性(SNP)89，SNP 87，SNP 83，SNP56，SNP45和SNP41等6个SNPs与缺血性脑卒中危险密切相关。

此后，全球的脑血管病研究学者掀起了研究该基因的热潮，但是难以达成共识。Staton等〔15〕在对澳大利亚人 PDE4D基因高度保守区进行系统性多态性研究基础上，对初次缺血性脑卒中患者PDE4D基因的6个SNP进行多态性分析，发现PDE4D SNP 89，SNP 87，SNP 83 及 PDE4D 单模标本89－87－83 与缺血性脑卒中有重大关联，这和对冰岛人的研究结果是一致的。但是没有证明脑卒中与PDE4D SNP 56、SNP 45或SNP 41存在显著的关联。Kostulas等〔17〕对瑞典人的病例－对照研究发现缺血性脑卒中与SNP45关联不大，但单模标本SNP45－41与缺血性脑卒中密切相关。Kim等〔20〕挑选韩国患者PDE4DSNP41作为候选标记，但是在病例和对照之间PDE4D SNP 41基因型的分布没有发现重大的不同〔20〕。而 Song等〔2〕对美国人的病例－对照研究结果表明，在基因5′端的一个内含子中发现的SNP rs918592与缺血性脑卒中的相关密切。Munshi等〔21〕对印度250个病人和250个健康人的病例－对照研究表明，SNP83与缺血性脑卒中关联重大而SNP87关联不大。对这些显然相矛盾的结果最可能的解释是，SNP检测与缺血性脑卒中不是直接连锁的，而是与原因等位基因不均一连锁的，这在不同的人群中不同。此外，Liao等〔22〕对高雄医科大学附属医院2006年1月到2007年11月的脑卒中病人研究表明，PDE4D的遗传效应在男性中明显而在女性中不明显。这些结果表明对PDE4D基因还有待更进一步的研究。

5 展望

缺血性脑卒中是世界范围内死亡和长期残疾的三大原因之一，给患者家庭造成了严重的经济和心理负担。缺血性脑卒中危险环境因素和遗传因素的研究对其预防和治疗起到一定的作用。缺血性脑卒中等位基因PDE4D的发现使缺血性脑卒中的预防与治疗进入了一个新纪元。PDE4抑制剂咯利普兰引入到临床更是对缺血性脑卒中治疗达到了极好的效果。

PDE4D基因SNP的研究结果表明，缺血性脑卒中在不同的人群中的SNP定位是不同的。这就为缺血性脑卒中的预防与治疗增加了相当的难度。因此，应进一步研究PDE4D在缺血性脑卒中的过程中的作用分子机制，以及不同的SNP定位的对缺血性脑卒中的影响，为临床治疗提供治疗靶点。

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