乳及乳制品中皮革水解蛋白检测方法的研究进展

青岛市饲料兽药检测站 穆阿丽 李 彦 初晓娜 徐秀玲 李 辉 吴 燕

皮革水解蛋白因其成本廉价，被不法分子添加到乳及乳制品中用以提高蛋白质含量，但是添加水解蛋白不仅会改变乳的口感和风味，改变乳的溶解度，降低乳中氨基酸的吸收利用率，而且“鞣革”下角废料中含有的重金属铬，如果被人体吸收蓄积，可导致关节疏松、肿大、造成人体重金属中毒（刘学琴等，2010）。2009年，卫生部将皮革水解蛋白公布为《食品中可能违法添加的非食用物质和易滥用的食品添加剂品种名单 （第二批）》。

羟脯氨酸（hydroxyproline，Hyp）是胶原蛋白所特有的氨基酸，在正常胶原蛋白中含量约13.63%（李景红等，2007），是衡量机体胶原含量的一个重要指标，在弹性蛋白中含量极少，在其他蛋白质中很少发现，因此由测定羟脯氨酸的质量浓度再乘以相应的系数可以得到胶原蛋白的含量（沈同和王镜岩，1980）。目前羟脯氨酸的测定方法很多，主要有比色法、氨基酸自动分析仪测定法、高效液相色谱法、高效液相色谱-质谱联用法、毛细管电泳法等，本文就上述各种检测方法作一阐述。

1 比色法

比色法又称分光光度法，因其操作简单、经济实用，是目前最为常用的一种方法。

比色法的原理是利用羟脯氨酸难挥发，在紫外区有微弱的吸收，没有荧光基团等性质进行检测。胶原蛋白在浓酸的条件下，经过高温长时间水解，彻底变成游离的氨基酸。其中的羟脯氨酸首先用氯胺T氧化生成含吡咯环的物质，然后用高氯酸溶液除去剩余的氯胺T，以对二甲基氨基苯甲醛溶液作为显色剂，生成红色化合物，用紫外可见分光光度计测定558 nm处的吸光值，从而得到羟脯氨酸的质量浓度。

刘学琴等（2010）用比色法测定生鲜乳中皮革水解蛋白得出羟脯氨酸浓度在0～2.0 μg/mL呈良好的线性关系，R=0.9998，其平均回收率为100.2%。李景红等（2007）用此法测得的回收率为94.38%～102.61%，重复性试验标准偏差为0.06，变异系数为1.74%。孔晓峰等（2011）采用此法测定结果表明，L-羟脯氨酸为0.00～1.11μg/mL时具有良好的线性关系（r=0.9990），在100～300 μg/mL时平均回收率为98.7%，相对标准偏差为6.3%。王红道等（2009）采用比色法测定乳制品中掺加动物胶原水解蛋白，回收率为96.7%～109.2%，平均回收率为100.4%，标准偏差为0.05，变异系数为1.56%。戴绚丽等（2009）研究得出该方法的线性范围为0.002～3 μg/mL，回收率为90.6%～94.1%，相对标准偏差<1.5%。张笑等 （2010）采用比色法测定得出的检出限为2.1 μg/g，回收率为91.6% ～101.3%，相对标准偏差为1.71%～2.45%。

通过对以上实验研究可以看出，采用比色法测定皮革水解蛋白其回收率均较高，能够满足实验室的一般需求。目前用该法水解样品最少也需要 6 h（刘学琴等，2010）。 丁毅等（2011）研究了一种微波辅助水解比色法测定动物水解蛋白中羟脯氨酸的快速检测方法，结果表明：通过微波辅助水解法对动物水解蛋白水解4～8 min与传统加热水解16 h所得的羟脯氨酸含量基本相同，采用吉大-小天鹅所研制的新型羟脯氨酸快速检测仪及其配套试剂盒进行测定，羟脯氨酸浓度范围为0.10×10-3～2.50×10-3g/L时，其吸光度与浓度具有良好的线性关系，加标回收率90%～105%。采用该方法和仪器可以作为乳及乳制品中水解蛋白的快速筛选方法。

2 氨基酸自动分析仪测定法

氨基酸自动分析仪测定法的原理，是L-羟脯氨酸经过阳离子交换柱的分离作用，能与其他氨基酸分离，再与茚三酮反应生成黄色产物，在波长440 nm检出。

曾暖茜等（2008）用氨基酸自动分析仪测定乳制品中L-羟脯氨酸，当L-羟脯氨酸质量浓度为5～30 mg/L，L-羟脯氨酸的质量浓度与峰面积之间线性关系良好，样品的相对标准偏差为2.2%，加标回收率为94.9%～105%。张秀尧等（2009）采用此法测定得出检出限为0.3 mg/L，加标回收率为96.8%～107%，相对标准偏差为0.40%～4.9%。

与比色法相比，氨基酸自动分析法避免了氨基酸衍生产物的多样性和氨基酸衍生不彻底等问题，样品处理简便易操作，快速、准确、灵敏度高，但其费用较高，普通实验室难以实现，而且存在需要较多缓冲液、反应温度高、反应速度慢、用途单一等局限。

3 高效液相色谱法

采用高效液相法（HPLC）测定羟脯氨酸含量，常用的衍生法有柱前衍生和柱后衍生。柱后衍生法有很多缺点，如色谱仪器较复杂，需要额外的泵和反应器，而且由于衍生剂的影响对检测设备要求很高，所以现在常使用柱前衍生法。柱前衍生是一种先将氨基酸转化成衍生物，再进行色谱分离的衍生方法。柱前衍生高效液相色谱法分析L-羟脯氨酸常用的柱前衍生试剂是邻苯二甲醛 （Hutson 等，2003）、丹酰氯（Sormiachi等，1995）、氯甲酸芴甲酯、2，4-二硝基氟苯 （李景红和孟祥晨，2008）。

李景红和孟祥晨（2008）采用高效液相色谱测定牛乳中掺加胶原水解蛋白，以2，4-二硝基氟苯为衍生试剂。研究表明，羟脯氨酸质量浓度为2～10 mg/L时，浓度与峰面积之间具有良好的线性关系，回收率为93.47%～101.20%，检出限为2.5 mg/L，相对标准偏差为1.62%。金苏英等（2009）采用柱前衍生反相高效液相色谱法测定奶粉及其他乳制品中L-羟脯氨酸的含量。以6-氨基喹啉基-N-羟基琥珀酰亚氨基甲酸酯 （AQC试剂）衍生水解样品中的L-羟脯氨酸。结果显示，浓度为0～2.05 mmol/L，标准曲线呈良好的线性关系（r=0.9991），加样回收率为95.1% ～101%，相对标准偏差为1.3%（n=7）。胡华等（2010）采用柱前衍生法分析酱油中羟脯氨酸含量。样品经乙醇提取，以2，4-二硝基氟苯为衍生试剂，L-羟脯氨酸质量浓度与其峰面积在10～320mg/L时具有良好的线性关系，相关系数为0.9992。回收率为97.19% ～110.18%，检出限为2.5 mg/L。

上述研究表明,高效液相色谱法具有较高的准确度和良好的重现性，具有分析时间短，成本低，重现性好，适用样品范围广等特点，可作为乳及其他乳制品中L-羟脯氨酸含量的检测方法。但由于该方法要对样品进行衍生，反应操作复杂，而且有些氨基酸衍生物不稳定，衍生反应的副产物和试剂本身会对测定产生干扰。赵燕燕等（2010）采用高效液相色谱-蒸发光散射检测法 （HPLCELSD）测定奶制品中动物水解蛋白含量，该法不需对样品进行衍生，操作简单，灵敏度高。结果表明，羟脯氨酸的线性范围为10～1000 μg/mL，r=0.99993（n=5），最低检出限为 5 μg/mL，平均回收率为99.83%，RSD为2.77%。

4 高效液相色谱-质谱联用法

高效液相色谱-质谱联用法（HPLC-MS）是利用质谱灵敏、专属、能提供分子量和结构信息的特点，将高效液相色谱和质谱联用的一种方法。

王一红等（2006）采用HPLC-MS法，用电喷雾ESI源，在正离子模式下建立了18种游离氨基酸的测定方法，通过选择反应监测（SRM）方式对18种氨基酸的母离子及子离子进行监测，并用三级四极质谱测定。测得结果回收率为95%～104%，相关系数0.9931～0.9999，检出限为0.5～8 mol/mL。

夏金根等（2008）建立了一种简单、快速地测定胶原蛋白中羟脯氨酸的高效液相色谱-电喷雾质谱（HPLC-ESI/MS）方法。以茶氨酸为内标，利用质谱定性定量测定羟脯氨酸。浓度为11.7～117 mg/L时，羟脯氨酸与内标物茶氨酸的峰面积比和羟脯氨酸的质量浓度呈良好的线性关系，相关系数为0.9993。含量测定的相对标准偏差为1.87%，回收率为97.85%～101.76%。

此方法分析时间短且无需衍生处理，抗干扰能力强，能准确快速地测定胶原蛋白中羟脯氨酸的含量，但该方法因其实验设备、耗材贵，方法不完善等，目前尚未广泛采用。

5 毛细管电泳法

毛细管电泳是一种可对多肽和蛋白质进行分析的重要液相分离技术，具有进样量少、绝对灵敏度高、分辨率高等特点。将毛细管电泳与光学检测或电化学检测技术相结合，可以对氨基酸进行分离。

薛静等（2005）研究表明，毛细管电泳-联吡啶钌电致化学发光法，可以检测人尿中脯氨酸和羟脯氨酸含量。而且该法还可排除其他多种氨基酸对羟脯氨酸的干扰，并具有毛细管电泳分离羟脯氨酸的高效性和电致化学检测的灵敏性。

邹晓莉等（2006）采用毛细管电泳-激光诱导荧光检测法分离测肌腱中的L-羟脯氨酸。结果表明，在（0.5～8）×103μg/L质量浓度范围内线性关系良好，检出限为0.5 μg/L。相对迁移率和相对峰高的相对标准偏差分别为5.0%和6.1%，加标回收率为95%～110%。毛细管电泳-激光诱导荧光检测可大大提高测定的灵敏度，已有诸多报道采用毛细管电泳-激光诱导荧光检测法测定氨基酸，并取得满意的分析结果（Yong等，2001）。而将该法用于测定L-羟脯氨酸，国内外仅有少量报道（Dugan 等，2000）。

6 小结

羟脯氨酸是胶原蛋白中所特有的氨基酸，以羟脯氨酸为特征性指标是检测乳及乳制品中皮革水解蛋白的常用方法。目前检测乳及乳制品中皮革水解蛋白的方法都需要进行水解或衍生，不能满足现场快速检测的需要，因此一种能够简便、快速、准确测定羟脯氨酸的方法或仪器，是我们今后研究的主要方向。

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