布拉酵母抗腹泻作用机制研究进展

农业部饲料生物技术重点开放实验室 胡小媛 滕 达＊ 张 勇 王建华＊

中国农业科学院饲料研究所基因室

福建师范大学生命科学学院 黄建忠＊

布拉酵母（Saccharomyces boulardii）于 20 世纪20年代由法国微生物学家Henri Boulard首次发现并分离，后被确认为酿酒酵母的一个亚种（Canani等，2011）。与普通酿酒酵母比，布拉酵母更具有作为益生菌的生物学优势，如其耐高温（在37℃生长良好）和耐酸性环境（在pH为2环境下1 h后细胞存活率仍能达到75%）（Edwards-Ingram 等，2007；Fietto 等，2004）。布拉酵母具有缓解腹泻症状的独特作用。有研究报道，日粮中同时添加中乳酸菌、芽孢杆菌及布拉酵母组的断奶仔猪2周后腹泻率比对照组 （只饲喂日粮组）降低74%，而只添加乳酸菌和芽孢杆菌腹泻率仅比对照组降低42%，说明布拉酵母具有防治畜禽腹泻的独特效果（Giang等，2012）。但目前关于其防腹泻机制的尚不十分清晰,本文就布拉酵母抗腹泻作用机制作一综述。

1 抗微生物作用

1.1 分泌抗毒素物质 布拉酵母能产生几种特异抗病原菌毒素蛋白，从而可防止由病原菌毒素引起的腹泻。目前已从布拉酵母发酵液中分离出三种抗毒素蛋白。第一种为54 kDa丝氨酸蛋白酶，能降解难辨梭菌（Clostridium diffcile）产生的两个蛋白外毒素（毒素A和毒素B）及毒素A在结肠上的刷状缘膜受体，从而抑制两种毒素对肠细胞表面的结合，保护肠道免受毒素侵害（Castagliuolo 等，1999）。第二种蛋白为 120 kDa 蛋白，其作用是中和霍乱弧菌（Vibrio cholera）产生的霍乱毒素（CT），抑制CT对肠细胞腺苷酸环化酶的激活，降低cAMP过度分泌，减少氯离子流失，从而维持细胞正常渗透压，避免水分大量流失（Czerucka和Rampal，1999）。 第三种蛋白为 63 kDa碱性磷酸酶，其作用是通过去磷酸化作用抑制大肠杆菌内毒素活性（Buts等，2006）。

1.2 抑制黏附宿主细胞表面 布拉酵母通过提供病原菌黏附受体或分泌一些物质抑制病原菌对宿主的黏附。某些肠道病原菌能黏附在肠道黏膜上皮细胞表面。例如，大肠杆菌和沙门氏菌通常通过I型菌毛凝集素识别并结合宿主细胞表面特异性糖类受体，进而定植于肠道壁上，在肠道繁殖并分泌毒素，从而引起疾病（Badia等，2012a；Martins等，2010）。阻止病原菌与肠道上皮细胞的黏附，可以防止大部分细菌感染发生。有研究发现，酵母细胞壁成分可以作为抗黏附剂，其作用是通过提供替代黏附位点以防止某些肠道细菌的黏附，这种抗黏附策略适用于具有甘露糖特异I型菌毛的肠道细菌，如大肠杆菌或沙门氏菌属 （Ganner和Schatzmayr，2012）。布拉酵母细胞壁中的甘露寡糖与肠上皮细胞黏附位点极其相似，从而使病原菌黏附于布拉酵母细胞表面，从而阻止病原菌对宿主细胞表面的黏附。而对于不依赖I型菌毛黏附宿主细胞病原菌，布拉酵母也可对其进行干扰，如具F4菌毛的肠毒性大肠杆菌（ETEC）K88对甘露糖具有耐受性（Devriendt等，2010），但可特异性识别β-半乳糖残基，布拉酵母含丰富的β-半乳糖残基，可与ETEC K88的F4黏附素结合，使其黏附到布拉酵母细胞表面，试验表明，用布拉酵母（MOI=3）或 β-半乳甘露聚糖（10μg/mL）处理，使得ETEC K88 GN1034对猪小肠上皮细胞系IPI-2I黏附率比对照下降 80%（Badia等，2012b）。Murzyn等（2010a）发现，布拉酵母细胞及其发酵液提取物均可抑制白色念珠菌对人肠细胞系Caco-2和Intestin 407的黏附，认为其机制为布拉酵母分泌癸酸，抑制白色念珠菌菌丝体形成，影响生物膜的形成，从而降低白色念珠菌对肠细胞的黏附。同时经过癸酸和布拉酵母提取物处理白色念珠菌后用实时定量PCR检测其毒性相关基因的表达谱，结果显示，HWP1、INO1及CSH1表达有所降低（Murzyn 等，2010b）。

1.3 抑制侵入宿主细胞 某些细菌致病的一个重要步骤是侵入宿主细胞内，布拉酵母可通过维持肠道屏障功能或阻碍病原菌运动从而阻止病原菌侵入宿主细胞。例如，致病性大肠杆菌（EPEC）感染T84细胞后，细胞通透性提高，紧密连接相关蛋白zonula occluden（ZO）-1分布改变，布拉酵母可通过增强受感染细胞的紧密连接结构，延迟受感染细胞凋亡，没有改变黏附细胞的数量但使细胞内 EPEC数量减少 50%（Czerucka等，2000）。 Martins等（2010）研究发现，用鼠伤寒沙门氏菌处理T84细胞，导致跨上皮电阻减少，通透性提高，而用布拉酵母和鼠伤寒沙门氏菌混合处理T84细胞，其跨上皮电阻和细胞通透性均维持正常状态，说明布拉酵母能保护细胞屏障功能，从而阻止病原菌侵入宿主细胞。Mumy等（2008）研究结果显示，布拉酵母虽不能抑制志贺氏菌黏附及侵入宿主细胞，但通过影响紧密连接相关蛋白zonula occluden-2，增强肠上皮屏障完整性，从而减轻炎症。此外，运动性利于细菌侵入细胞，例如，在肠道内，细菌可通过鞭毛运动穿过黏膜侵入到肠细胞内部。Pontier等（2012）试验发现，当鼠伤寒沙门氏菌1344单独与人结肠细胞T84培养时，其平均曲线运动速度（CLV）为 43.3 mm/s，当有布拉酵母存在时，其CLV降为31.2 mm/s，可见，布拉酵母改变了细菌运动速度。进一步通过非运动鞭毛缺陷性鼠伤寒沙门氏菌的运动和入侵相关性研究表明布拉酵母可改变鼠伤寒沙门氏菌的运动和轨迹，或许可以解释布拉酵母能够影响沙门氏菌的入侵机制。

2 免疫调节作用

2.1 调节宿主细胞信号及炎性因子表达 布拉酵母帮助机体对抗病原性腹泻的另一个重要机制是提高宿主肠黏膜免疫反应。大肠杆菌、沙门氏菌、难辨梭菌、志贺氏菌等病原菌结合肠上皮细胞膜表面受体（如 Toll like receptors，TLRs），激活宿主细胞中丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）及核转录因子κB（NF-κB）等。MAPK主要包括细胞外调节蛋白激酶ERK1/2、p38激酶及JNK激酶，是参与转录因子激活及其他细胞效应信号通路的重要分子（Robinson 和 Cobb，1997）。 NF-κB 可调控许多炎症因子的表达，是许多细胞包括肠上皮细胞中炎症反应的最重要调控者。正常情况下，NF-κB与抑制剂IκB结合，当受到炎性细胞因子、细菌或细菌产物刺激后，IκB降解，NF-κB进入细胞核激活某些炎性细胞因子 （如白细胞介素IL-8基因、肿瘤坏死因子TNFα等）的基因转录，进而引起机体炎症反应 （Pothoulakis，2009；Mumy 等，2008）。布拉酵母破坏MAPK活性，干扰NF-κB介导信号转导通路，进而减少IL-8表达，增加抗炎性细胞因子（如IL-4和IL-10）表达，从而保护机体免受炎症性腹泻 （Canani等，2011；Fidan 等，2009；Chen，2006）。

Dahan等（2003）研究结果显示，肠出血性大肠杆菌EHEC能促进结肠腺癌T84细胞中转录因子NF-κB的抑制剂IκBα降解，进而提高NF-κB DNA结合活性，去除EHEC引起的肌球蛋白轻链（MLC）磷酸化，同时激活ERK1/2和p38激酶，介导IL-8大量表达。T84细胞感染EHEC前用布拉酵母处理可抑制IκBα降解，降低NF-κB DNA结合活性，减少IL-8分泌。Martins等（2010）先用鼠伤寒沙门氏菌感染T84细胞导致IL-8大量分泌，再用布拉酵母处理，结果IL-8分泌显著减少，但MAPK及NF-κB的活性未受到影响，且IL-8 mRNA水平没有减少；在鼠伤寒沙门氏菌感染T84细胞之前先用布拉酵母处理，则JNK、ERK1/2及NF-κB活性均受到抑制，且IL-8在mRNA水平和分泌水平上均降至正常水平，说明布拉酵母在转录及翻译阶段都影响IL-8表达。热处理布拉酵母，则丧失抑制MAPK效果，但其细胞壁悬浮液仍具抑制能力，表明在布拉酵母细胞壁上有抑制MAPK的物质存在。

肠上皮细胞和树突状细胞对维持肠道免疫稳态有重要作用（Rimoldi等，2005）。最近研究结果显示，在猪肠上皮细胞IECs中，布拉酵母能在转录或翻译水平上抑制沙门氏菌对炎症细胞因子，如 TNF-α、IL-1α、IL-6，粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子（GM-CSF）及趋化因子等的诱导作用。在树突状细胞（DC）中，布拉酵母与沙门氏菌同时处理组与仅用沙门氏菌处理组相比，TNF-α、GMCSF及趋化因子CXCL8转录水平略有提高，说明DC可能被布拉酵母激活，但在肠毒素大肠杆菌ETEC感染DC的情况下，布拉酵母对DC激活无影响，其机制有待进一步研究 （Badia等，2012）。Thomas等（2009）研究结果显示，布拉酵母通过调节DC形态、功能及迁移，抑制DC对LPS的免疫反应，从而抗炎症。

布拉酵母还可促进过氧化物酶体增殖激活受体-γ（PPAR-γ）表达，PPAR-γ 是一种核受体，在结肠上皮细胞中对炎性细胞因子调控转录具有重要作用，若干扰PPAR-γ表达，将会减弱布拉酵母对IL-8表达的抑制作用，说明PPAR-γ在布拉酵母阻断IL-8表达中起重要作用 （Lee等，2008）。除了布拉酵母细胞可调节炎症反应，其发酵上清也具有此功能（Mumy等，2008）。研究表明，布拉酵母产生的一种小分子（<1 kDa）、可溶于水且热稳定的抗炎症因子SAIF，可干扰LPS、IL-1b及TNF-a对NF-κB的激活，进而抑制NF-κB对IL-8基因表达的激活，抑制IL-8在肠表皮细胞和单核细胞中的表达（Sougioultzis等，2006）。

2.2 促进抗体产生 IgA是机体黏膜免疫中非常重要的一种抗体，它可以抵抗黏附在肠黏膜上的病原菌（Martins 等，2009）。 Qamar等（2001）用布拉酵母对预先经难辨梭菌类毒素A处理的小鼠进行灌胃，使小肠总IgA量提高1.8倍，IgA特异抗毒素A水平提高4倍，表明布拉酵母可促进机体免疫球蛋白IgA产生，增强肠道免疫反应，从而有效防治腹泻。

3 调节肠道微生态环境

抗生素治疗引起肠道菌群比例失调，导致腹泻，被称为抗生素相关腹泻（AAD）。肠道菌群比例失调导致肠道微生物有益代谢活动减少。例如，胆盐代谢、短链脂肪酸SCFA分泌显著减少，引起肠道微生态失衡，一些致病菌，如产酸克雷伯菌和难辨梭菌等会乘机大量繁殖。Barc等（2008）采用菌群特异性16S rRNA荧光原位杂交结合流式细胞仪定量分析对口服阿莫西林克拉维酸小鼠肠道中真菌、溶组织梭菌、肠道杆菌群、双歧杆菌属等，结果发现，抗生素处理后接受布拉酵母处理的小鼠能快速恢复肠道菌群平衡，比对照组提前1～2周，腹泻疗程缩短。此外，有试验表明，布拉酵母还能释放多胺到肠腔中，如亚精胺和精胺水平分别提高21.4%和21.9%，进而提高微绒毛中刷状缘膜酶，包括乳糖酶、蔗糖酶、异麦芽糖酶等双糖酶的分泌，从而促进肠绒毛生长，改善机体消化吸收能力，提高抗体对抗病原体能力（Buts，2008；Buts等，1994）。

4 小结

综上所述，已有大量动物试验及临床研究证明布拉酵母对肠道疾病的疗效。但相关药代动力学方面的系统研究明显欠缺，并且涉及该菌在肠道发挥作用的有效剂量、时间，与其他微生态制剂或药物互作配伍关系等问题均需进一步研究。此外，由于布拉酵母不耐胆盐以及抗冻能力差，以至于基于细胞保活目标的包被保护等制剂技术已然成为饲料领域应用瓶颈急待突破。总之，有必要夯实相关理论和应用研究，进一步明确作用机制、拓宽适用范围、提高应用实效，以为推动布拉酵母作为饲料抗生素替代品的有益尝试提供必要的理论支持。

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