超声靶向微泡破裂在分子生物学中的应用

金佳美（综述） 陈 明（审校）

超声靶向微泡破裂在分子生物学中的应用

金佳美（综述） 陈 明（审校）

超声靶向微泡破裂；基因疗法；分子生物学

【中国图书资料分类法分类号 】R445.1

超声微泡自1968年由Gramiak及Shah报道发现至今，已广泛应用于提高超声诊断的分辨力、敏感性和特异性。然而超声微泡的作用并不仅仅局限于临床超声诊断，近年来，超声靶向微泡破裂（ultrasound-targeted microbubble destruction, UTMD）技术在分子生物学领域迅速发展，利用微泡在超声介导下的空化效应可以达到靶向给药、靶向治疗的作用。Lawrie等[1]发现使用超声联合微泡造影剂对血管内皮细胞进行质粒DNA转染，转染效率较裸露DNA增加了近3000倍。自此，UTMD在基因治疗中的重要作用逐渐得到认识和发展。本文就UTMD在分子生物学中的应用最新动态作一综述。

1 UTMD的转染原理

超声波本身具有促进基因转染的作用[1]，联合使用超声造影剂微泡可进一步提高转染效率，其原理主要是目的基因通过表面黏附或内部包裹的方式与微泡结合，然后通过超声介导在靶细胞或组织中，由微泡靶向传输基因或药物[2]，超声波的空化效应可以导致组织细胞膜通透性增高，而微泡又能降低超声波的空化阈值，从而增强空化效应，使局部毛细血管破裂，邻近组织细胞间隙增宽，从而使目的基因更容易进入组织细胞内而提高局部组织及细胞的基因转染和表达，达到基因治疗疾病的目的[3,4]。Hallow等[5]证明空化效应释放出强大的声能，引发多种生物学效应，形成声孔。细胞膜出现暂时且可逆的小孔，使细胞外大分子能够得以进入细胞的现象称为声孔效应，声孔效应可能是基因成功转染的基础。虽然空化效应和机械效应使细胞膜通透性增加是增强基因转染的主要原理，但UTMD促进基因转染效率的确切机制尚不明确。Bekeredjian等[6]认为目的基因的转染也与超声、质粒及微泡的结合方式有关，由此可以认为细胞膜通透性增加不是UTMD增加转染效率的唯一机制，而是多因素影响的过程，其详细机制仍在进一步研究中。

2 UTMD在药物传输中的应用

超声造影剂微泡可以通过不同方式携带药物，通过特殊的声孔效应经静脉途径靶向给药，超声辐照介导微泡造影剂定向释放药物，这种效应可以改变药物的分布，增加药物局部浓度，减少不良反应。康娟等[7]发现多西紫杉醇脂质微泡联合UTMD能抑制兔VX2肝癌的微血管生成，从而抑制兔VX2肝癌的生长。

溶栓治疗已经成为超声微泡药物运输系统的应用方向，在理想条件下，超声联合微泡可以完全溶解血栓[8]。Flores等[9]发现将溶栓剂组织型纤溶酶原激活物和超声微泡联合应用不仅能有效溶栓，还能显著降低急性脑卒中患者的颅内出血。

UTMD对于肿瘤、炎症、血栓等都有显著的治疗效果，对多种组织器官的疗效也在不同动物模型中得以证实，相信在进一步完善各项参数条件后，UTMD能够真正运用到临床治疗中。

3 UTMD在基因转染中的应用

自2000年首次报道UTMD用于体外基因转染以来，该技术在体内外实验中均取得较显著的效果，用于转染各个系统脏器。作为一种非病毒转染方法，UTMD较传统的脂质体、阳离子聚合物等方法显示出其独特的优势。

3.1 UTMD在肿瘤基因治疗中的应用 目前常用的UTMD肿瘤基因治疗方法主要有以下几种：①自杀基因疗法，又称为基因介导的酶前药物治疗。Li等[10]发现超声介导下自杀基因KDRP-CD/TK对乳腺癌MCF-7细胞有显著的抑制作用。Zhou等[11]将单纯疱疹病毒胸苷激酶（HSV-TK）自杀基因微泡通过UTMD技术作用于小鼠肝癌模型，效果明显。②抗肿瘤新生血管形成疗法。Kou等[12]通过RNA干扰（RNAi）技术阻断血管内皮生长因子受体后，肿瘤血管生成减慢。而通过UTMD技术完全可以靶向干预血管内皮生长因子受体，得到相同甚至更佳效果。③基因替代疗法。Luo等[13]利用UTMD将野生p53基因转染视网膜母细胞瘤Y79细胞，不仅较传统转染方法效率更高，抑制作用也显而易见。④反义基因疗法。载反义mRNA微泡经超声介导转染神经胶质瘤细胞，经检测肿瘤特异蛋白表达水平显著降低，充分说明其抑制作用。可见，UTMD在肿瘤基因治疗中具有良好的应用前景。

3.2 UTMD在组织器官基因治疗中的应用 除肿瘤外，在心血管[14]、肺[15]、脑[16]、脊髓[17]、子宫[18,19]、胰腺[20]、肾脏[21]、视网膜[22]、皮肤[23]、睾丸[24]等的转染实验中，UTMD均表现出安全和高转染效率的优点。UTMD 可高效、靶向转染目的基因而无明显组织损伤，是一种安全、简单、有应用前景的非病毒基因传输方法。

4 UTMD的影响因素

UTMD对不同器官组织作用程度的不同会造成药物传输及基因转染效率的不同，主要受到3个方面的影响：一是介导超声的参数；二是所使用微泡的特性；三是微泡输入的途径及超声微泡作用局部的环境。

与超声相关的参数变量有声强、持续时间、频率、束流截面、衰减作用等。对超声参数的优化主要体现在参数设定方面，即能够产生足够的声能形成尽可能多的外溢孔，使得所传输的药物及基因能够进入细胞及组织间隙中，提高药物作用效能及基因转染效率，但这应基于在细胞组织耐受并不会产生明显不良反应的基础上。因此，对超声参数的优化对于成功地应用UTMD介导药物传输或基因转染都是至关重要的。在组织能耐受的情况下高声强和低频率超声照射对细胞转染是最为有效的[25]，且超声辐照的时间不宜过长，否则微泡会因为长时间的超声辐照而被大量清除，使转染效率降低[26]。Zarnitsyn等[27]采用pEGFP-N1及pGL3对DU145前列腺癌细胞进行转染，以优化转染过程中声强、微泡浓度、细胞密度、质粒浓度、温度、辐照时间等转染条件，实验结果显示，优化后的超声参数能够在保证细胞耐受及DNA质粒完好的条件下提高转染效率。

微泡的性质也是UTMD介导药物传输及基因转染的重要因素，只有适合的微泡才能完成运输转染。微泡相关变量有微泡外壳成分构成、微泡中气体的性质、剂量、浓度、输注时间等，当超声微泡结合脂质体或阳离子聚合物时，也会明显增加转染效率[19]。除自制的微泡外，获批上市的微泡造影剂有 SonoVue、Levovist、Optison、De fi nity、Sonazoid及biSphere等。Wang等[28]用携带绿色荧光的DNA质粒分别与SonoVue、Optison和Levovist混合，结果显示，Optison在没有超声介导的条件下即能够提高转染效率。在超声辐照的条件下，Optison也能够提高基因转染效率，但是与仅使用Optison造影剂条件下的转染率无明显差异。而SonoVue在联合超声辐照后，转染效率较单独使用时明显增加。只有Levovist无论是否结合超声辐照对转染效率均无明显益处，在没有超声辐照的条件下反而会降低转染效率，而且较SonoVue及Optison的安全性低。Optison及SonoVue能提高转染效率在很大程度上与其自身化学组成有关，Optison微泡的白蛋白外壳及八氟丙烷气体、SonoVue微泡的磷脂外壳及六氟化硫气体不同于Levovist微泡的半乳糖外壳及空气，带正电荷的白蛋白及阳离子脂质体均有助于基因转染，而且全氟化碳气体溶解度比空气低，保证其稳定性更佳，同样拥有脂质体外壳及全氟化碳气体的De fi nity微泡对基因转染也起促进作用，证明了这一点[29]。而SonoVue结合超声能够进一步提高转染效率是因为超声作用时产生的声孔效应比作用于Optison的转染过程更为明显。故建议在基因转染实验中选用SonoVue、Optison及De fi nity等白蛋白或脂质体外壳，全氟化碳气体的微泡造影剂更为适合。Li等[30]分别比较Optison、Imagent和De fi nity 3种超声微泡对心肌血管通透性的作用，结果显示，3种微泡对微血管损害的潜在性无明显差异，仅De fi nity组有较多的微血管渗出。

由于UTMD介导转染还受到造影剂给药途径、转染部位、超声仪器等因素的影响，对UTMD各方面影响因素的限定至今仍无法达成共识。

5 UTMD的安全性

自超声造影剂问世以来，其安全性备受关注。2007年，FDA要求在超声微泡造影剂标签上加上黑框警告，以警告其有引起严重心肺反应的危险，因为有4例患者在注射造影剂当时或之后30min内死于心脏骤停，还有一些患者发生严重但非致死性的心肺并发症。但一系列大规模回顾分析[31,32]证明了超声微泡造影剂使用的安全性后，FDA修改了黑框警告。

UTMD技术所要求的超声参数与诊断用超声不同，为高声强、低频率、高强度超声，会引起组织细胞不可逆的损伤[33,34]。此外，超声联合微泡所产生的空化作用，即在微泡破裂的瞬间所释放出的巨大声能与高温，都会使组织细胞受损伤的风险大大增加，已有超声联合微泡引起组织出血、血管内溶血、体外培养细胞和含气组织及器官损伤的报道[35]。并有学者认为UTMD还能通过局部产生自由基和微射流，引起血管内皮损伤，进一步损伤细胞和组织。

目前绝大多数学者认为UTMD较病毒转染方式相对安全。Hynynen等[36]将去除部分颅骨的新西兰兔作为实验模型，采用超声联合微泡造影剂对实验模型的脑部进行20s辐照，声强为16 ～ 690W/cm2，实验结果显示，联合微泡超声局部辐照可使血-脑屏障短暂地、可逆地开放，并不引起损伤。此外，大多数关于UTMD的实验多采用离体器官或细胞为研究对象，使用剂量远大于临床所需剂量。所以UTMD在药物传输及基因转染过程中对人体产生损伤的概率应该很低。

6 UTMD的应用前景

目前基因治疗需要寻找一种安全、高效、可重复、靶向性强的转运载体，而UTMD技术的出现正可以解决这个难题，虽然该技术的效率相对于病毒转染方式很低，但是它克服了病毒转染的细胞毒性及免疫原性问题，创伤小、安全性高，也可以直接携带药物进行治疗，在分子生物学中具有广阔的应用前景。

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10.3969/j.issn.1005-5185.2012.11.021

同济大学附属东方医院心脏中心 上海200120

陈 明 E-mail： mingchen1283@vip.163.com

2012-01-10

2012-08-03

（责任编辑 张春辉）