光学探针在活体成像中的应用

李战军（综述） 张洪武（审校）

光学探针在活体成像中的应用

李战军（综述） 张洪武（审校）

光学成像；活体成像；模型，动物

【中国图书资料分类法分类号 】R-33

近年来，随着各种光学探针的不断出现，非侵入性、可实时观测的动物活体光学成像技术迅速发展。该技术能够在不对活体动物造成额外损伤或仅产生微小损伤的前提下研究生理状态下的生物活体，与传统成像技术互补性强，日益收到国内外学者的重视[1]。但小动物活体荧光成像目前仍面临2个主要问题：①不透明的生物组织会吸收、反射和散射光子，并产生强烈的自发光，这些问题都会使信号采集和定量变得困难。②生物活体环境非常复杂，对成像用对比剂或发光探针的要求非常苛刻。随着光学探针的不断改进，人们在小动物活体荧光成像的基础上开发了生物发光成像、上转换发光成像、时间分辨发光成像、长余辉发光成像、多模式联合发光成像多种方法。本文通过介绍各种光学成像技术的基本特点，对各种光学探针面临的问题、最新研究进展和发展方向作一综述。

1 荧光成像

700～1000nm的近红外光是有效的光学成像窗口。在这一近红外光学成像窗口，生物组织的吸收较弱，而且生物组织几乎不会产生近红外荧光。最常见的有机近红外荧光探针是聚甲炔类染料，其中五甲炔花青和七甲炔青色素是最常用的近红外荧光染料。作为常见的无机荧光探针，量子点是无机半导体发光纳米材料（＜10nm），已经成为多功能的生物成像工具。量子点的独特光学性质包括[2]：①荧光波长连续可调；②量子产率高，吸收光谱宽，发射光谱窄；③Stokes位移大；④抗光漂白能力强；⑤多色量子点可用同一波长激发实现同时检测。虽然抗体、多肽及其他功能分子使量子点能够应用于活体的肿瘤荧光成像，但光子组织穿透性差，深层组织自发荧光和光吸收、光反射、光散射等光学成像的固有问题仍然极大地限制了量子点在小动物活体荧光成像中的应用。因此，人们开始研制近红外发光的量子点，将动物组织的光吸收最小化，进而改善量子点荧光信号的组织穿透性[3]。

传统的荧光团，尤其是有机染料，易于受到光漂白的影响。这些荧光团的荧光信号在数分钟内的持续激发下明显减弱。因为缺少长时间的光稳定性，所以将传统的荧光团用作活体荧光标记仍然存在一些障碍。而高能量的激发光存在光子穿透深度小和潜在光损伤等问题[4]。鉴于此，虽然荧光染料种类非常丰富，但是吲哚菁绿仍然是目前唯一一种被美国食品药物管理局（FDA）批准的可以应用于临床的荧光染料[5]。作为活体荧光标记，量子点也有自身的局限性。尽管最近的研究报道称未发现Ⅱ～Ⅳ族量子点对实验鼠有明显的活体毒性，但是要将量子点应用于临床，重金属元素镉的毒性是亟待解决的问题[6]。

2 生物发光成像

生物发光是指生物体发光或生物体提取物发光的现象，它不需要生物体对激发光的吸收，而是靠生物体产生的荧光素酶催化底物的氧化还原过程将化学能转化为光能的化学发光过程。生物发光最常用于评价表达荧光素基因的移植细胞的数量和定位。一般将表达荧光素基因的肿瘤细胞移植到模型动物体内，注射合适的生物发光底物之后，产生的生物发光信号与肿瘤细胞的数量呈正相关，使得能够通过生物发光现象原位动态地观察肿瘤细胞的迁移、生长、增殖过程，为评价抗肿瘤药物的有效性提供了一种强有力的工具[7]。Galkin等[8]利用生物发光原理研究TAE684分子对淋巴瘤的抑制作用，发现TAE684能够抑制淋巴瘤细胞增殖。尽管生物发光活体成像在研究生物过程中具有非侵入性、可实时跟踪监控、极高的信噪比、信号强度与细胞增殖呈正相关等独特优势，但自身也有很多局限性。常见的荧光素酶包括萤火虫荧光素酶、Renilla荧光素酶、磕头虫荧光素酶和Gaussia荧光素酶，多数生物发光是蓝色、绿色发光，不适合深层组织的活体生物发光成像。生物发光活体成像需要改变实验对象的遗传基因，目前仅限于模型动物研究，不太可能直接应用于人体[7]。

3 上转换发光成像

典型的荧光过程是一个线性过程，具有Stokes位移现象，即吸收一个较短波长的光子，发射一个较长波长的光子。从能量的角度来说，典型荧光团的发射光能量要小于激发光能量。与此不同的是，上转换发光过程（upconversion）是一个非线性反Stokes过程，它能够把较低能量的激发光转换为较高能量的光发射。上转换发光过程需要1个以上光子的参与。多光子激发造成上转换发光过程的激发光光子能量小于发射光光子能量，造成激发光波长比发射光波长更长[9]。上转换纳米颗粒的基本结构一般是将过渡金属元素、稀土元素或锕系元素掺杂进入无机晶体基质的晶格中。因为大多数稀土元素（除La、Ce、Yb、Lu外）具有多个亚稳态能级，稀土元素成为目前占据主导地位的上转换掺杂元素。基质材料能够很大程度上决定上转换发光的性质和效率。共掺杂Yb（Ⅲ）/Er（Ⅲ）或Yb（Ⅲ）/Tm（Ⅲ）的NaYF4纳米颗粒具有最高的上转换发光效率[10,11]。在980nm近红外光激发下，NaYF4：Yb,Er的上转换发光位置位于407nm、521nm、539nm、651nm。NaYF4：Yb,Tm 的 上 转 换 发 光 位 置 位 于450nm、479nm、649nm[12]。

体外及活体实验均表明稀土掺杂的上转换发光纳米颗粒具有很好的生物相容性，因此，上转换发光纳米颗粒比量子点更适合用于生物成像应用。在近红外区，生物组织几乎没有自发荧光，而上转换发光纳米颗粒可以被低能量的近红外光激发，这样不仅减小了对生物体造成的光损伤，改善了光学信号的组织穿透性，还有效地回避了与传统荧光团活体成像相关的大部分问题。上转换发光纳米材料即使经过数小时的持续激发仍然能够保持很好的光稳定性。另外，上转换发光纳米材料不像量子点那样存在间歇发光或闪烁现象，故可以观察单个颗粒的发光成像[13]。上转换发光纳米材料面临的最大问题是上转换发光效率普遍较低，通常是用980nm的激光激发。一旦通过纳米技术解决这一问题，上转换纳米发光材料是最有可能应用于人体的纳米发光探针。

作为一种新型的成像对比剂，上转换发光纳米颗粒已应用于多种体内外成像实验中。Chatteriee等[14]的研究结果表明，聚乙烯亚胺包裹的50nm的NaYF4：Yb,Er纳米颗粒可以应用于大鼠深层组织成像。Idris等[15]应用上转换纳米颗粒标记跟踪移植的细胞。以上研究提示上转换纳米颗粒在活体生物成像和活体诊断方面具有巨大的应用潜力。

4 时间分辨发光成像

荧光寿命是指荧光分子被激发到激发态之后，在发射光子产生荧光之前停留在激发态的平均时间。常见的生物内源荧光团（自发荧光）、荧光染料、荧光蛋白、量子点等的荧光寿命非常短，一般在纳秒数量级，而发光稀土配合物的荧光寿命却长好几个数量级，可以达到微秒（Yb、Nd）、毫秒（Tb、Eu）数量级（表1）[16]。利用飞秒激光技术和长寿命荧光探针，在关闭激发光一定时间之后，短寿命的背景荧光已经衰减完毕，而长寿命的荧光探针还在继续发射光子，此时采集荧光信号可以有效地屏蔽背景荧光信号。人们很早就认识到荧光寿命是成像方法中一个十分有用的荧光参数，荧光寿命可以在任何使用荧光现象的场合得到应用。但是由于需要借助高速电子设备和数据分析计算设备，直到20世纪末出现了更高级的仪器和激光技术（如瞬态荧光光谱仪、高灵敏度CCD相机和飞秒激光技术等）之后，时间分辨荧光成像的概念才开始出现[16]。目前，时间分辨已经可以借助各种各样的新型技术来实现，如单光子和双光子显微镜、内镜、断层扫描等。基于时间分辨原理的各种应用报道开始大量出现。由于稀土配合物的荧光寿命长，所以大量的时间分辨报道集中于稀土配合物。尽管稀土发光配合物具有荧光寿命长、量子产率高、发射峰位置固定且很窄、发射光谱多样（Tb绿光，Eu红光，Nd、Er等近红外发光）等优点，但由于稀土配合物的激发光通常在紫外光区，而紫外光组织穿透性差，会造成生物组织光损伤，并不适合小动物活体成像，所以目前的时间分辨荧光成像仍主要停留在体外细胞成像实验[17]。但通过调节配体的化学结构，使稀土发光配合物的激发光延长到可见光区[18]。Sun等[19]制备的新型近红外发光稀土配合物的激发光可以从紫外光区延伸到＞500nm的可见光区。一旦稀土配合物的激发光能够高效地延伸到可见光区，应用于小动物活体的时间分辨荧光成像必将取得巨大突破。

5 长余辉发光成像

长余辉发光材料有超长的发光寿命，目前多种颜色包括蓝色、绿色、红色长余辉发光材料生成工艺成熟，已经实现商品化。经可见光激发并移除激发光源后，其长余辉发光时间可持续达数小时到十几小时。随着纳米科技的快速发展，纳米尺寸的长余辉发光材料开始出现并不断拓宽长余辉发光材料的应用领域[20-22]。Chermont等[23]于2007年首先用分级法从溶胶凝胶法制备的近红外长余辉发光材料Ca0.2Zn0.9Mg0.9Si2O6：Eu,Dy,Mn中分离出少量纳米粉体，并将其用于小鼠活体发光成像。Maldiney等[24]报道了近红外发光亮度更高的长余辉发光材料CaMgSi2O6：Eu,Mn,Pr的余辉发光亮度是Ca0.2Zn0.9Mg0.9Si2O6： Eu,Dy,Mn的4倍，提示可以在小鼠体内观察更长时间。

长余辉发光纳米材料可以将发光材料的激发和发射过程分开，这样不仅可以有效地避免激发光产生的生物自发光产生的背景，提高信噪比，还可以避免激发光对实验动物造成的光损伤。但是，长余辉材料一般需要在高温条件下制备，难以制备单分散的、水溶性的、纳米尺寸的长余辉材料，而且高温制备的长余辉材料缺乏能够连接功能分子的活性基团。这些问题都极大地阻碍了长余辉发光材料在生物医学领域的应用。

6 多模式联合成像

活体光学成像技术组织穿透性差，三维空间分辨率低，但如果将活体光学成像与解剖学成像方法（如MRI和CT等）联合使用，将有助于弥补光学成像的不足，并提供相互补充的信息。基于此，多功能探针日益引起各国学者的密切关注，相关研究报道日益增多，如荧光-MRI双模式成像[25]、上转换发光-MRI双模式成像[26]、荧光-PET双模式成像[27]、荧光-SPECT双模式成像[28]。实际上，多模式联合成像是最有

可能成为光学成7 结束语

像最终应用于临床的应用方式。

小动物活体光学成像有自身的独特优势，可以和现有的医学成像方法相互补充，为生物医学的发展提供有力的研究工具。不同的光学成像方法都有各自的优点，同时也面临一些问题。但活体光学成像的发展还依赖于性能更加优异的发光探针。随着新型发光探针的开发，活体光学成像技术必将成为应用于生物医学领域更强大的研究手段。

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10.3969/j.issn.1005-5185.2012.11.020

中国科学院“百人计划”项目（09i4281c10）；国家重点基础研究发展计划（2010CB434800）。

中国科学院城市环境研究所 福建厦门 361021

张洪武 E-mail： hwzhang@iue.ac.cn

2012-01-30

2012-07-18

（责任编辑 张春辉）