前列腺癌靶向基因治疗实验研究的最新进展

潘东亮 综述 那彦群 审校

北京大学首钢医院泌尿外科，北京大学吴阶平泌尿外科医学中心，北京100144

由于去势抵抗性前列腺癌(castration-resistant prostate cancer，CRPC)缺乏有效的治疗方法催生了探索新治疗模式的需求，其中靶向基因治疗是治疗前列腺癌较理想的模式，既可单独使用也可与其他方法联合应用。但因缺乏令人满意的基因载体以及旁观者效应的降低而影响了其临床应用，因此世界各地的科学家进一步致力于靶向基因、载体、应用方法和治疗方案的研究。

1 靶向基因

单纯疱疹病毒(herpes simplex virus，HSV)- 腺苷激酶(thymidine kinase，TK)/更昔洛韦(ganciclovir，GCV)系统是前列腺癌治疗领域中应用最广泛的自杀式基因之一，但是其效果有限。为此，Chen等［1］尝试构建了双靶向的新型基因系统：即由前列腺特异性膜抗原(prostatespecific membrane antigen，PSMA)驱动的表达HSV-TK和connexin43(Cx43)基因的第五代非病毒载体G5-PAMAM-D(generation 5 polyamidoamine dendrimers)，通过一系列体内外实验证实，G5-PAMAM-D 可以有效地向前列腺癌PC-3细胞输送重组质粒，HSV-TK和Cx43在前列腺癌细胞内均能成功表达；G5-PAMAM-D能有效诱导前列腺癌PC-3细胞凋亡，抑制癌细胞生长，降低瘤体增长速度；当与吉西他滨联用时则可以引起更多的前列腺癌细胞凋亡。

大肠杆菌嘌呤核苷磷酸(purine nucleoside phosphorylase，PNP)是最新发现的自杀式基因，而且PNP/氟达拉滨可被前列腺特异性的鼠probasin为基础的启动子ARR2PB 输送。被腺病毒(adenovirus，ADV)·ARR2PB-PNP转染后的前列腺癌细胞在雄激素类似物R1881存在的情况下对低浓度氟达拉滨(LD50，0.1 μg/mL)即敏感，而且旁观者效应比ADV-巨细胞病毒(cytomegalovirus，CMV)-HSV-TK/GCV强。ADV·ARR2PB-PNP/氟达拉滨治疗组的瘤体明显小于对照组，且存活时间显著延长，甚至部分鼠存活时间达到160 d，且没有全身不良反应［2］。细胞周期G2/M 期基因UBE2C是CRPC特异性雄激素受体(androgen receptor，AR)靶基因，是CRPC生长必需的。细胞周期G1/S期抑制剂-779可以抑制AR阳性CRPC细胞模型abl和C4-2B中UBE2C mRNA和蛋白表达，涉及的分子机制是：减少AR共激动子SRC1、SRC3、p300、MED1与UBE2C增强子的结合，导致RNA多聚酶Ⅱ供给UBE2C增强子减少和UBE2C mRNA稳定性衰减，进而显著降低UBE2C依赖性癌细胞增殖和侵袭［3］。因此，提示UBE2C有望成为前列腺癌基因治疗的新靶点。

Sec62是内质网膜上蛋白转位工具的组成部分，在前列腺癌患者的癌组织内Sec62蛋白水平升高，这与癌细胞的再分化程度增高有关。沉默前列腺癌细胞株PC3的Sec62基因后，癌细胞的转移和侵润力被阻断或显著性降低，但是癌细胞活力几乎不受影响，因此Sec62基因可作为肿瘤治疗的靶向基因［4］。另外，被以腺病毒为载体的ADV-CMV-NDRG2(N-myc downstreamregulated gene 2，N-myc 下游调控基因-2)感染后的前列腺癌细胞株PC3增殖受到显著抑制，提示NDRG2可成为前列腺癌基因治疗的靶点；但是NDRG2在增生的前列腺组织内高表达，而在前列腺癌组织内的表达水平很低［5］，所以NDRG2基因的实际应用前景不乐观。

基因FABP5编码皮肤脂肪酸结合蛋白，在前列腺癌中上调，扮演了癌基因的角色。小干扰RNA(small interfering RNA，siRNA)定靶FABP5后的atelocollagen悬浮液被注射在BALB/c裸鼠前列腺癌PC-3M瘤体周围，发现10和15 μmol/L siRNA治疗组的平均瘤体的体积是对照组的1/3；而与加扰siRNA治疗组相比，10 μmol/L FABP5 siRNA缓冲液和1或5 μmol/L siRNA的atelocollagen悬浮液差异无统计学意义(P>0.05)。尽管15 μmol/L的siRNA比10 μmol/L能更大幅度地缩小肿瘤体积，但两者差异无统计学意义(P>0.05)。10和15 μmol/L剂量治疗的瘤体内C-FABP表达水平低于其他组，显示借助atelocollagen液注射到前列腺癌周围的FABP5 siRNA能有效抑制裸鼠前列腺癌细胞生长，当剂量>10 μmol/L时则呈效果-剂量正相关［6］。

分化显示编码3(differential display code 3，DD3)是最多见的前列腺癌特异性基因之一。应用微小DD3启动子代替病毒原有启动子E1A基因构建溶瘤腺病毒Ad·DD3-E1A，再配以治疗性基因白介素(interleukin，IL)-24增强它的抗肿瘤活性，形成腺病毒Ad·DD3-E1A-IL-24，兼具前列腺特异性和出色的抗肿瘤活性，能通过诱导前列腺癌细胞凋亡和抑制血管生成机制发挥抗肿瘤作用，因此未来Ad·DD3-E1A-IL-24也可以用于前列腺癌的治疗［7］。

Shao等［8］研究发现，在50%以上的前列腺癌细胞里表达TMPRSS2/ERG融合基因。通过脂质体纳米载体输送的高特异性siRNAs治疗鼠原位和皮下前列腺癌，结果显示此介质输送的高特异性siRNAs治疗作用强，且特异性高，抑制肿瘤生长的程度与融合基因的敲除程度呈正相关，无不良反应。因此，TMPRSS2/ERG融合基因可作为高特异性siRNAs治疗前列腺癌的靶向基因。

2 载体

由于腺病毒能感染体内许多不同种类的细胞，易引起高度不良反应，而且目标癌细胞经常不易被野生型腺病毒感染，因此腺病毒自身的诸多缺点也使以腺病毒为载体的基因治疗效果大打折扣。Magnusson等［9］拟通过构建双靶向腺病毒载体降低非靶向不良反应和增加对前列腺癌的靶向感染力。除了病毒再定靶于HER-2/neu基因外，再把聚氯基中的病毒RGD基序变成EGD，第三轴重复的KKTK 基序换成RKSK，产生载体Ad(ZH/3)。这种含ZH的载体能制成高滴度且特异于靶点，对雄激素依赖性Her2/neu阳性PC346C前列腺癌细胞具有有效的感染力和杀伤力。说明这种可定靶于Her2/neu的腺病毒载体可用于前列腺癌的治疗，改进了前列腺癌基因治疗的载体工具。

杆状病毒是一种昆虫病毒，对人类没有致病性，是一种充满希望的基因治疗载体。由于实体肿瘤生长和转移主要依赖血管生成和hEA(human endostatin and angiostatin)，hEA是一种包括人内皮抑素和血管抑素的混合蛋白，具有强大的抗血管生成和抗肿瘤作用，因此通过构建hEA-杆状病毒载体研究了杆状病毒用于表达hEA癌症基因治疗的可行性。向裸鼠移植瘤内注射病毒载体可以抑制肿瘤生长、显著延长鼠存活时间而无不良反应，提示杆状病毒具有成为癌症基因治疗良好载体的潜能［10］。

非病毒载体也推动了癌症基因治疗的发展，其中最常用的是阳离子脂质体和纳米粒子。对肿瘤而言，理想的基因治疗必须是向肿瘤细胞高效率地输送质粒DNA (plasmid DNA，pDNA)或合成的siRNA，而且不良反应轻或无。Hattori［11］研发了一种新型包括胆固醇-3β-对羧基氨基乙烯-N-羟基苯乙胺(cholesteryl-3betacarboxyamidoethylene-N-hydroxyethylamine，O H-C h o l)和T w e e n 8 0 的阳离子纳米粒子(nanoparticle，NP)，通过向瘤体内注射的方式测试此NP具有向前列腺癌细胞株PC3种植瘤高效转染pDNA 和siRNA的作用。由于人类多种肿瘤内过度表达叶酸受体(folate receptor，FR)，维生素叶酸也已被用于FR介导的药物输送，因此可用于靶向输送。叶酸与NP结合形成了包括OHChol、Tween 80和叶酸—聚乙烯乙二醇—二硬脂酰磷脂酰乙醇胺共轭的与叶酸链接的纳米粒子(NP-F)，经向FR阳性鼻咽癌瘤体内注射可明显抑制肿瘤生长。说明以阳离子胆固醇为基础的NP是治疗局限性肿瘤的非病毒pDNA和siRNA载体，为下一步尝试治疗前列腺癌奠定了基础。

由于目前现有的人工载体系统是单靶的，依然受有效性和特异性输送的困扰，对应受体类型很少，无一例外地均在靶细胞上表达。因此，Nie等［12］合成了双受体靶向多聚复合物，模仿自然病毒的双周期进入细胞特征，借助双受体内化机制增加了载体的有效性和特异性，如在聚乙二醇化聚醚酰亚胺为基础的多聚复合物的双靶向载体系统里，转铁蛋白靶向蛋白B6和精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸多肽是两个结合配体。通过多次两个前列腺癌细胞株细胞分离、细胞摄取、转染有效性和相应竞争性实验，结果均显示这种载体系统具有较高的特异性。

3 途径

3.1 低频超声放射或“sonoporation”方法

Zolochevska等［13］报道，IL-27是最近鉴定的IL-12相关性细胞介质家族成员，具有基因治疗前列腺癌的作用，能使肿瘤生长停止并介导肿瘤消退。为了使IL-27定靶于前列腺癌，尝试了一种向肿瘤细胞输送基因的新模式——低频超声放射或“sonoporation”的方法，利用sonoporation引导IL-27基因治疗前列腺癌细胞，结果显示sonoporation能增强前列腺癌内效应细胞的聚集，使IL-27表达增多，有效减缓前列腺癌生长，提示sonoporation基因治疗方法策略可行。

3.2 前列腺内注射

Sonpavde等［14］通过前列腺内注射表达肿瘤抑制基因Glipr1的腺病毒进行了对中、高危前列腺癌患者的一期临床新辅助试验，19例患者接受了单次6 vp剂量的ADV- Glipr1注射，结果能观察到全身免疫反应和抗肿瘤的生物活性，不良反应主要为尿道感染(3例)、排尿困难(1例)、流感样综合征(3例)和发热(1例)。

由于跨膜蛋白claudin-3和claudin-4是产气荚膜杆菌肠毒素(Clostridium perfringens enterotoxin，CPE)的靶向受体，两者结合能激发膜孔复合物形成，引起细胞死亡，所以Walther等［15］通过前列腺内注射野生型CPE cDNA 或优化型CPE cDNA基因，治疗过表达claudin-3和-4的前列腺癌。结果显示，基因注射72 h后不良反应达100%；与野生型CPE cDNA相比，优化型CPE cDNA不良反应产生快速但效果更强。

Kawauchi等［16］使用腺病毒-人肿瘤抑制基因REIC/Dkk-3(adenoviral vectors -human tumor suppressor gene REIC/Dkk-3，Ad-hREIC)行鼠前列腺内注射，与对照组相比可观察到AdhREIC的凋亡和抗肿瘤效果，认为腺病毒介导的REIC/Dkk-3行原位注射基因治疗对于前列腺癌的临床治疗是有用的。当局部注射低剂量Ad-REIC时，发现介质生物分布到前列腺、膀胱和结肠；当注射大剂量时介质分布得更远，可到肺、胸腺、心、肝和肾上腺；而且只有当注射大剂量时，才能在前列腺内观察到急性炎症反应而其他组织无异常［17］。因此推测，通过前列腺内注射而实施的腺病毒介导的原位REIC/Dkk-3基因治疗对于治疗人前列腺癌是安全的；结合上述3组试验结果可以得出，通过前列腺内注射途径进行基因治疗可行性强的初步结论。

4 方案

4.1 靶向基因治疗与内放疗联合

Barton等［18］研发了具有复制作用的配备两个自杀式基因和人碘化钠转运体(human sodium iodide symporter，hNIS)基因的腺病毒Ad5-yCD/mutTK(SR39)rep-hNIS。其中hNIS是与细胞核结合的示踪基因，当它与放射性131I结合时发挥部分治疗作用。在经直肠超声引导下，根据标准的注射模式向6例患者的前列腺内注射5 mL的Ad5-yCD/mutTK(SR39)rep-hNIS，分成12个注射点，通过单光子发射计算机断层成像技术检测前列腺中hNIS基因的表达。结果显示，6例患者的前列腺内hNIS基因的表达率为100%，平均每个前列腺体积的45%覆盖着表达基因。这种组合体为下一步前列腺癌的对照研究提供了条件。

4.2 靶向基因治疗与免疫治疗联合

鼠和人的基因Glipr1和GLIPR1/RTVP-1在许多癌细胞系(包括前列腺癌)中作为具有凋亡前活性的p53直接靶点。裸鼠原位和转移前列腺癌瘤内注射转导和表达Glipr1的腺病毒载体AdGlipr1，均可产生明显的治疗效果。与空白对照组相比，AdGlipr1转导的巨噬细胞表面积增大、CD40、CD80和MHCⅡ分子表达增多、合成更多的IL-12和IL-6。向瘤体内注射AdGlipr1转导的巨噬细胞能显著抑制前列腺肿瘤生长和肺转移，延长存活期。这些数据提示瘤体内注射的AdGlipr1转导的巨噬细胞能顺淋巴结的引流方向移动，诱导全身自然杀伤细胞的活性和肿瘤特异性细胞毒T淋巴细胞应答的产生［19］。另外，TRAIL慢病毒转导淋巴细胞后形成的TRAIL-淋巴细胞增强了细胞毒效应，血液输注TRAIL-淋巴细胞及肿瘤细胞或肿瘤周围注射TRAIL-淋巴细胞能减缓前列腺癌生长甚至凋亡，TRAIL-淋巴细胞联合双重特异性抗体EpCAMxCD3能增强抗凋亡和抗增殖信号和减少肿瘤血管形成而加速肿瘤消除［20］。因此，这种新型的方法能通过诱导抗肿瘤免疫应答发挥更有效的治疗作用，提示这种基因-免疫联合治疗可能是支持体内免疫反应、治疗进展期前列腺癌的新方法。

4.3 靶向基因治疗与化疗联合

在体外实验中，在pIRES质粒中构建由PSMA启动子驱动的双自杀式基因联合5-氟胞嘧啶和巨细胞病毒，用于前列腺癌细胞株的体外治疗实验中，发现可高度抑制前列腺癌生长；进而体内实验中可观察到去势裸鼠内种植瘤生长延缓和转移灶消亡，显示特异性双自杀式基因与化疗联合的策略是治疗前列腺癌的潜在选择［21］。

4.4 靶向基因治疗与抗病毒药物联合

Terao等［22］研究了激素抵抗前列腺癌患者接受了单纯疱疹病毒胸腺嘧啶核苷激酶(osteocalcin promoter-driven herpes simplex virus thymidine kinase，Ad-OC-TK)联合伐昔洛韦(valacyclovir，VAL)治疗对生活质量影响程度的问卷调查。6例患者分别在第0、14、28天填写了欧洲癌症研究和治疗组织的前列腺癌专用生活质量调查表。结果显示所有项目评分及总评分均显著改善，病毒的不良反应不明显；同时揭示了前列腺特异性抗原水平与身体疼痛改变显著相关。调查结果说明了Ad-OC-TK联合VAL能显著改善患者短期生活质量和因局部复发或转移灶引起的疼痛。

5 结语

尽管前列腺癌靶向基因治疗在上述4个方面的研究成果显著，但是如下情况仍没有彻底扭转：作为最常用基因载体的腺病毒在人体内的使用、特别是静脉内注射的安全性和条件性复制的可实用性受到限制，腺病毒对靶细胞的有限感染性和进入病灶前不可避免地要经受肝脏和免疫系统不同程度的清除。因此，对CRPC靶向基因治疗的研究仍任重道远，达到一线治疗目标仍没有明确的时间表；不过靶向基因治疗依然是最具潜力、最具希望的CRPC治疗方法，其缺点可通过尝试多次定靶、新型靶向输送方法(如超声)、联合分子靶向治疗等方式逐步解决。

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