宫内感染HBV婴儿免疫失败与IL-2、IFN-γ表达的相关性研究①

梅 燕 廖 滔 邓新琼 唐 玲 蔡 稔 (广西柳州市妇幼保健院妇产科，柳州545001)

乙型肝炎疫苗和乙型肝炎免疫球蛋白联合阻断乙型肝炎病毒母婴传播的作用已十分肯定，但近年来仍有10%～20%的母婴传播阻断失败。乙肝病毒宫内感染是新生儿出生后乙肝疫苗接种失败的主要原因。如何降低宫内感染HBV免疫失败率是目前国内外专家致力的方向，其中细胞因子调控网络与宫内感染HBV接种乙肝疫苗失败的关系是他们研究的热点话题。白介素2(Interleukin-2，IL-2)是1976年Morgan等人用植物血凝素(PHA)、刀豆蛋白A(Con A)等刺激T淋巴细胞产生的一种因子，它主要是由 CD4+细胞产生，能直接刺激T细胞增殖，激活T细胞、B细胞和NK细胞等多种免疫细胞，并且能诱导产生γ-干扰素，诱导多种细胞因子的产生、细胞因子受体表达和产生新型的杀伤细胞(LAK细胞)［1］，对HBV的免疫清除有赖于正常的IL-2产生和IL-2R的表达，IL-2分泌异常时，细胞免疫功能发生障碍［2］。本研究探讨宫内感染HBV婴儿免疫失败与外周血单核细胞不同刺激下细胞因子IL-2、IFN-γ水平的相关性，从而探讨免疫失败的原因及可能有效的预防措施，为降低免疫失败和慢性HBV携带状态的发生提供理论依据。

1 资料与方法

1.1资料

1.1.1研究对象及分组 选择2007年7月至2008年7月广西柳州市妇幼保健院产科住院无症状的乙肝表面抗原(HBsAg)阳性孕妇分娩的新生儿50例，其在出生后立即肌内注射200 U乙型肝炎免疫球蛋白(HBIG)，并于出生时、1个月、6个月分别注射酵母重组乙型肝炎疫苗，每次10 μg，出生后7个月时进行随访抽取静脉血检测HBV血清学标志物及HBV-DNA。20例HBV血清学标志物均为阴性的孕妇分娩的婴儿作为正常对照组。研究组病例孕期均符合以下标准：(1)血清 HBsAg和(或)HBeAg阳性，孕妇自孕28周起肌内注射 HBIG，分别于28、32、36周各肌注200 U HBIG;(2)血清甲、丙、丁、戊、庚等肝炎系列检查呈阴性;(3)孕期未使用其他研究药物、抗病毒药物、细胞毒性药物或皮质类固醇激素类药物;(4)无其他产科并发症及合并症(如胎膜早破、先兆早产、先兆流产、妊娠高血压等);(5)肝、肾功能正常;(6)孕期无明显感染性疾病(如阴道炎及TORCH感染、艾滋病、梅毒等);(7)B超排除胎儿畸形。所有病例均排除父亲有乙肝病史。总共70例孕妇共分娩70例新生儿。HBsAg阳性孕妇分娩的婴儿和正常对照组新生儿出生时的体重、Apgar评分、性别及分娩时胎龄、分娩方式比较，均无明显差异。

1.1.2标本采集及处理 在婴儿家属知情同意下，出生7个月时，抽取70例婴儿静脉血2 ml装肝素抗凝管留作试验用，50例研究组婴儿多抽取3 ml做乙肝标志物检测及HBV-DNA定量。

1.1.3主要耗材与仪器 耗材：Hank＇s液、淋巴细胞分离液、10%小牛血清的RPMI1640、0.2%台盼兰染液、计数板、植物血凝素、酵母重组 HBsAg、IFN-γ和IL-2 ELISA试剂盒。仪器：4℃低温离心机、倒置显微镜、自动酶联检测仪。

1.2方法

1.2.1PBMC的分离、刺激和培养 常规分离PBMC，用RPMI1640完全培养液调整细胞浓度为2×106个/ml，取等量的细胞悬液与0.2%台盼兰染液混合，计算出活细胞百分率达95%以上。将外周血单个核细胞悬液等量分成3份置于不同的培养瓶中，分别加入PHA(终浓度为10 μg/ml)，酵母重组HBsAg(终浓度设置为 2.5 μg/ml)，RPMI1640(设为无刺激组)。置于37℃、5%CO2条件下培养48小时(h)。

1.2.2细胞因子定量 采用ELISA法。严格按照说明书进行培养液的上清液中IFN-γ和IL-2水平检测。ELISA步骤完成以后，记录吸光度(OD)，分别以标准品吸光度为纵坐标、标准品浓度为横坐标描绘标准曲线，然后，在标准曲线上根据样品的吸光度找到相对应的样品的浓度。

1.3统计学处理 采用SPSS软件进行统计。计量资料采用中位数(M)描述，不同组间的比较采用秩和检验(Kruskal-Wallis H法)，两两比较采用扩展t检验法。统计学检验水准为0.05，P＜0.05认为差异有统计学意义。

2 结果

2.1上清液IFN-γ水平的比较 采用ELISA法检测细胞培养上清液中IFN-γ、IL-2水平，非特异性刺激源(丝裂原)刺激诱导免疫反应时三组IFN-γ、IL-2分泌均增加，但3组比较无显著性差异(P=0.058;P=0.408)。在无刺激诱导时，免疫失败组较免疫有效组和正常对照组IL-2、IFN-γ的分泌低下。在酵母重组HBsAg 2.5 μg/ml刺激下，3组IL-2、IFN-γ分泌均有增加，3组比较均有显著性差异(P＜0.01;P＜0.01)。免疫失败组增加最明显，免疫失败组和对照组差异有非常显著性差异(P＜0.01;P＜0.01)。见表1。

表1 婴儿PBMC培养液的上清液IFN-γ、IL-2水平的比较(μg/ml)Tab．1 Levels of IFN-γ，IL-2 in newbaby PBMC culture suspension clear liquid(μg/ml)

2.2IL-2和IFN-γ的关系 在HBsAg刺激时IL-2和IFN-γ分泌呈正相关(r=0.335，P=0.005)。

3 讨论

乙型肝炎疫苗和乙型肝炎免疫球蛋白联合阻断是降低HBV母婴传播的一项非常有效的措施，但近年来文献报道仍有10%～20%的发生免疫失败，宫内感染是其主要原因。袁荣等［3］研究认为宫内感染HBV并侵犯PBMC，使其IL-2分泌能力下降，可能是导致新生儿免疫接种失败的机制之一。

本课题采用体外细胞培养和ELISA技术对18例宫内感染HBV免疫失败婴儿、32例宫内感染有效婴儿及20名正常婴儿外周血单个核细胞分别在丝裂原(植物血凝素)、酵母重组HBsAg刺激时γ-干扰素(IFN-γ)、白细胞介素2的分泌进行检测。发现非特异性刺激源(丝裂原)刺激诱导免疫反应时3组IL-2、IFN-γ分泌均有增加，但3组比较无显著性差异，说明对非特异性刺激源均存在细胞免疫反应，且不产生免疫耐受。在酵母重组HBsAg刺激诱导时，免疫失败组较免疫有效组和正常对照组IL-2、IFN-γ的分泌低下。在酵母重组 HBsAg 2.5 μg/ml刺激下，3组IL-2、IFN-γ分泌均有增加，3组比较均有显著性差异(P＜0.01;P＜0.01)。免疫失败组增加最明显，免疫失败组和对照组差异有非常显著性差异(P＜0.01;P＜0.01)。在HBsAg刺激时 IL-2和IFN-γ分泌呈正相关(r=0.335，P=0.005)。

宫内感染免疫失败的儿童外周血单个核细胞(PBMC)对乙型肝炎表面抗原(HBsAg)特异性增殖反应低下，IL-2产生和 IL-2受体表达不足，机体处于免疫耐受状态［4，5］。有研究认为新生儿在T细胞水平对HBV抗原的耐受程度与抗-HBs的产生滴度相关，这表明HBV宫内感染新生儿的免疫耐受大多是不完全的，通过使用细胞因子、免疫佐剂等方法部分可以消除或逆转，当耐受状态逐渐消除或逆转后方可产生免疫应答。HBsAg是一种胸腺依赖性抗原，它诱导机体产生抗-HBs必须经过抗原的提呈、辅助性T淋巴细胞的识别和B淋巴细胞的激活与分化，另外还需要多种免疫细胞与分子的共同参与。在这个复杂过程中任一步骤出现问题，都可导致机体对乙肝疫苗应答水平低下或无应答。根据近年来的研究，乙肝免疫球蛋白是通过增加Th1型细胞的活化，促进体内干扰素-γ、白细胞介素12的分泌达到清除新生儿体内 HBV的目的，并降低其体内HBV-DNA含量，从而有效降低新生儿HBV感染率。乙肝疫苗能诱发持久的特异性细胞及体液免疫应答。二者结合能够阻断80%～90%的HBV母婴传播。IL-2、IFN-γ均为Th1型细胞产生。IL-2重要的作用是能够诱导T淋巴细胞增殖和分化。T细胞受多种刺激后可分泌IL-2，诱导细胞分泌细胞因子(IFN-γ、IL-4、TNF 和 CSF 等)，同时，IL-2 还能作用于T细胞本身，诱导自身增殖、分化和发挥功能。IFN-γ是 NK细胞和 T细胞(包括 CD4+Th1和CD8+T细胞)都能产生，可作为抗原提呈细胞和T淋巴细胞的增殖、分化的调节因子，参与细胞炎症反应和抗病毒［6，7］。朱启镕等认为高表达量的 IFN-γ对病毒清除有重要作用。宫内HBV感染儿童外周血单个核细胞在HBsAg特异性刺激时IFN-γ分泌水平低于正常免疫儿童。说明HBV宫内感染与IFN-γ分泌水平不足有关。很多研究也证实了这一点。综上所述，IL-2与IFN-γ是一种诱导与被诱导的关系，同时IL-2还能诱导其自身增殖，有将免疫反应级联放大的效应，从本实验的结果来看，IL-2的表达与IFN-γ的分泌关系密切，所以我们推测增强免疫细胞产生IL-2的水平，可以促进IFN-γ的表达，从而打破细胞的免疫耐受，产生免疫应答。

本研究提示IL-2分泌能力低下，诱导IFN-γ产生的能力低下，可能是宫内感染导致乙肝疫苗失败的机制。因此外源性加入IL-2，加强特异性免疫反应，诱导免疫细胞产生足够的IFN-γ，或可消除或逆转免疫耐受，从而达到更有效的免疫应答，但是本实验的结果还需要大样本的研究验证，且这种免疫治疗的安全性和有效性还需要进一步深入的研究。

1 陈慰峰.医学免疫学［M］.第3版.北京：人民卫生出版社，2000：45-48.

2 Guidotti L G，Rochford R，Chung J et al．viral clearance without destruction of infected cells，during acute HBV infection ［J］.Science，1999;284(5415)：825-829.

3 袁 荣，王晨虹，刘晓梅 et al．HBV母婴传播致新生儿免疫失败的原因和机制［J］.第四军医大学学报，2005;26(7)：647-649.

4 俞 蕙，朱启镕，吕 晴et al．宫内HBV感染接种乙型肝炎疫苗小儿的细胞免疫功能研究［J］.中华传染病杂志，1997;15(1)：76-78.

5 朱启镕，于广军，吕 晴 et al．宫内感染乙型肝炎病毒儿童接种乙型肝炎疫苗免疫失败与其相关细胞因子关系研究［J］.中华儿科杂志，1999;37(7)：404-407.

6 王建设，朱启镕.宫内感染乙型肝炎病毒免疫失败儿童Ⅰ型和Ⅰ型细胞因子研究［J］.中华儿科杂志，2002;40(8)：481-484.

7 Guidotti L G，Chisari F V.Cytokine-mediated control of viral infections［J］.Virology，2002;273：221-227.