骨髓间质干细胞体外诱导分化神经样细胞功能的研究进展

任瑞芳 综述 黄良国 审校

遵义医学院附属医院神经内科 遵义 563000

1 体外诱导MSCs分化神经样细胞的功能

1.1 突触联系 神经系统传导通路发挥正常电生理和分泌神经递质最基本的解剖结构是神经突触。Gomes等［4］证实BDNF等神经营养因子可诱导核仁内RNA聚合酶－1（RNA polymerase－1）和细胞外信号调节激酶（ERK）1／2信号通路调控神经元核仁转录，并通过细胞外信号调控神经轴突的生长、延长和分支。汪智卿等［5］用IL－1a体外诱导MSCs，突触素染色阳性有表达神经递质产生突触联系的功能。Cho等［6］利用突触泡蛋白免疫染色和电生理研究证实，经维甲酸处理的MSCs可产生突触传递表达神经递质PPT－1基因，表明MSCs分化的神经样细胞具备可以分泌神经递质的神经突触。Yang等［7］单用bFGF就可以有效的诱导BMSC分化为神经样细胞，并随神经生长相关蛋白GAP－43的增长此神经样细胞可以显示出神经元的特征性电生理现象和高水平的神经细胞标志物。此外该实验还通过干扰成纤维细胞因子受体（FGFR－1）的RNA和细胞外信号调节激酶（ERK）特异性抑制剂U0126证明BFGF主要通过激活骨髓干细胞中的FGFR－1受体和蛋白激酶－C通路而调节MSCs向神经细胞分化，从而说明了信号传导通路的可能性。这些研究都证明了诱导后的神经样细胞具备产生神经功能最基本的神经生理解剖结构，为神经递质的分泌和正常神经电生理的产生奠定了基础。

1.2 神经递质 神经细胞的主要特征是能合成和释放神经递质调控跨越其表面膜的离子流而产生电信号。目前一些实验发现诱导后的神经样细胞具备去甲肾上腺素（NE）分泌的功能。Chen等［8］用维甲酸和胶质源性神经营养因子诱导MSCs，并用免疫细胞化学法鉴定、高效液相色谱法动态监测，据NE的浓度与峰面积绘制标准曲线和每1×107个细胞的去甲肾上腺素浓度作为主要观察指标。结果显示：MSCs培养14d时神经巢蛋白抗原表达阳性，20d时可见长突起的神经元样细胞，神经核蛋白也表达阳性。NE与峰面积之比有良好的线性关系，回归率为92.39%。体外诱导分化的神经样细胞及培养液中NE随时间相应增加，对照组则为阴性。具有神经营养作用的γ－氨基丁酸（GABA）是广泛存在于神经系统的一种神经递质，可促进神经前提细胞的成熟和迁移［9］。许燕等［10］用二甲亚砜（dimethyl sulfoxide，DMSO）和3，4－二羟基苯甲醚（butylated hydmxy lanisole，BHA）诱导人MSCs。RT－PCR检测诱导3d后GABA－α2和GABA－α3的mRNA表达阳性，表明人MSCs在一定诱导条件下可表达神经细胞的GABA受体。施雪英等［10］采用三七总皂甙对大鼠MSCs进行体外诱导后GABA也表达阳性，该实验证实三七总皂甙能促进MSCs向神经细胞的横向分化并明显延长分化细胞的存活时间，抑制细胞凋亡基因Bcl－2明显增加，凋亡基因bax明显减少。观察在加入诱导剂三七总皂甙后2 h见细胞质收缩，逐渐有突起形成；5h后多数细胞形成明显的神经元样细胞形态，胞体呈圆形，突起较长，双极或多极形，并在突起末端出现分支，部分相邻细胞的突起连接成网；8～12h后神经元特异性烯醇化酶有大量阳性表达，乙酰胆碱酯酶和γ－氨基丁酸均表达阳性。

人类的感觉、运动和行为等多种生理效应与广泛分布于脑组织内的5－羟色胺能神经节及5－羟色胺能神经元所分泌的5－羟色胺作用于不同的受体亚型有关。其可促进胶质细胞分化和髓鞘形成，在皮质发育、突触形成中起着重要作用［11］，是中枢及外周神经系统的重要神经递质。陈剑荣等［12］用BDNF和维A酸对MSCs进行培养和诱导，12d时见大而圆的细胞，Nestin抗原阳性；20d可见长突起神经元样细胞，神经核蛋白（NeuN）检测阳性。另外14d、20d的神经元样细胞及培养液均可检测到5－羟色胺且随时间增加其浓度也相应增加。

乙酰胆碱促进神经干细胞的增殖和分化［13］，胆碱乙酰转移酶（chAT）作为胆碱能神经元的标志酶是生成ACh的限速酶，常作为研究胆碱能神经元的标志或估计ACh含量（释放量）的间接指标。Woodbury等［14］发现骨髓间质干细胞分化的神经细胞是一种定量调控基因的表达而不是简单的开－关神经基因表达。MSCs不仅分化出中胚层神经细胞的mRNA，还可分化出内胚层和外胚层的基因，其分化的神经样细胞不仅具备微管蛋白－Ⅲ、神经丝蛋白－M、神经突触蛋白等特殊标记物的表达还可以分泌酪氨酸羟化酶和乙酰胆碱转移酶。

1.3 电生理特性 神经细胞的离子电生理对神经细胞发挥正常生理效应起着至关重要的作用。目前对于MSCs分化诱导的神经样细胞电生理的实验研究均表明该细胞具备成熟神经细胞的某些电生理特性。杨慧民等［15］用诱导剂（a－MEM，体积分数为20%胎牛血清，10μg／L碱性成纤维细胞生长因子）及诱导培养基（α－MEM，2%DMSD，200μmol／L丁羟茴醚）诱导的神经样细胞50个中有25个ATP电流（50%）、13个GABA电流（26%）、46个总钾电流（92%）、46个复极化钾电流（92%）。充分说明在诱导分化的神经样细胞上存在功能性离子通道，具备电生理特性。Jiang等［16］用BDNF、BFGF等细胞因子及细胞共培养等方法诱导分化的神经样细胞可长时间存活且表现出更为成熟的神经元形态。利用膜片钳记录出的大量数据，显示共培养5d后的神经元样细胞有22%的细胞能激发出可能与钠离子电压门控通道有关的峰电位，7～12d时高达80%～100%的细胞具备这种电生理特性，未共培养细胞则无此电生理特性。此特性与正常中脑神经元形态结构和电生理特性极为相似。Kohyama等［17］报道N－5杂胞苷与Noggin可诱导MSCs分化为功能成熟具有电生理特点的神经样细胞，膜片钳技术监测到的负相电流提示电压依赖性钾通道的存在，且加入乙酰胆碱后细胞出现快速可逆的Ca2＋内流。Noggin诱导后28d细胞外钾和谷氨酸盐水平升高，胞浆Ca2＋也迅速可逆性增加。

Mareschi等［18］用多种诱导方案体外诱导MSCs分化的神经样细胞电生理功能检测可见两股与钾通道相关的延迟整合钾离子流，这是细胞负性静息电位以及基本功能活性的维持所必须的。胡琳燕等［19］采用丹参对MSCs进行诱导分化，并利用细胞膜电位特异性的荧光探针DiBAC4（3）标记细胞，该方法可以在不损伤细胞膜的基础上更精确、更便捷地反应细胞的膜电位变化趋势。另外共聚焦检测细胞受高钾刺激的荧光变化显示：MSCs在第4次诱导后1h时NF表达率（95.3±1.6）%；5h后在高钾刺激下发生去极化，胞内荧光强度瞬时增强，而空白对照无反应。苏平等用银杏内酯B诱导大鼠MSCs为神经样细胞，并利用膜片钳技术检测细胞内离子通道电流，显示该神经样细胞除见钾电流IK外，还可见外向整流IA，类似神经元对照。说明银杏内酯B诱导的MSCs，不仅具有神经细胞的形态和免疫特性，还具备神经电生理功能。

2 问题与展望

虽然在MSCs诱导分化为具有正常生理功能的神经细胞方面已经具备了很多实验证据，但仍有很多问题需待进一步研究：（1）如何有效获得比较纯的MSCs，不同分化阶段的MSCs细胞学特点和细胞标志仍然没有非常特异的标记物；（2）如何更有效提升MSCs向神经细胞诱导分化的成活率分化率；（3）MSCs跨胚层诱导分化神经细胞的机制尚不清楚；（4）诱导分化后神经样细胞的鉴定及功能检测还需进一步的研究；（5）神经递质以及神经递质受体在MSCs增殖和分化中的信号传导也需进一步深入研究。

由于MSCs来源广泛，易于分离培养，并具有潜在多向分化潜能，作为传统不可再生细胞的种子细胞具有诸多优点，虽然目前还有许多问题尚未破晓，但相信随着研究的深入，MSCs一定会在未来再生医学领域展现广阔的应用前景。

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