大鼠脑缺血再灌注后海马CA1区星形胶质细胞与突触可塑性的关系

郭 涛 王新华 石 磊 陈宁宁 赵源征 张 敏 刘恒方

郑州大学第五附属医院神经内科 郑州 450052

神经生长相关蛋白（growth associated protein，GAP－43）是决定神经元发育和再塑的内在因素，在神经损伤情况下表达常显著增加，故将其作为特异性分子探针用于神经修复研究。星形胶质细胞（astrocyte，AS）在脑组织缺血时最易受损。胶质纤维酸性蛋白（glial fibrillary acidic protein，GFAP）作为AS数量变化的指标和特异性诊断物。本实验通过观察在缺血再灌注状态下神经突触可塑性变化与AS反应的动态关系，探索通过干预AS帮助神经突触形成，对临床治疗脑缺血再灌注损伤具有实际意义。

1 材料与方法

1.1 动物实验分组 甄选72只10～12个月的SD雄性健康大鼠，体质量300～400g（河南实验动物中心提供），随机分成缺血再灌注组和对照组各36只。对照组实验开始后12 h、1d、3d、7d、14d、21d分别处死6只。缺血再灌注组再分为脑缺血2h再灌注12h组、1d组、3d组、7d组、14d组，每组6只。

1.2 模型的制作 局灶性脑缺血再灌注模型制作采用常规线栓法。左侧大脑中动脉（middle cerebral artery，MCA）被插入线拴。自CCA分叉处开始栓线长18～20mm。线栓于缺血2h后抽出，即再灌注形成。不插入线拴即假手术对照，模型成功标志为线拴插入后出现左侧Horner征，大鼠清醒后出现右侧肢体偏瘫，Longa评分1～3分。

1.3 切片及取材制备 在相应时间点麻醉动物，分别取出心脏、大脑，固定，石蜡包埋。自海马开始连续冠状切片。HE染色选取7d缺血再灌注和对照组，每例样本均做GAP－43、GFAP组织免疫化学染色。

1.4 指标 （1）HE染色：光学显微镜下观察海马CA1区病理变化；（2）GAP－43、GFAP组织免疫化学染色：GAP－43兔多克隆抗体购自（Santa Cruz Biotechnology，Inc.USA）。GFAP兔多克隆抗体、二抗试剂盒SP9001抗兔均购自Vector Laboratories公司；GFAP、GAP－43阳性细胞胞浆或胞核被染成棕黄色。各切片在海马CA1区随机计数5个高倍视野（400×），测其积分光密度，取平均值，即为该切片平均积分光密度。

1.5 统计学方法 数据以均数±标准差表示。应用SPSS 12.0统计软件，两样本均数比较用t检验，多个样本均数间比较用单因素方差分析（one－way ANOVA），检验水准α＝0.05。

2 结果

2.1 灌注后表现 大鼠灌注后反应迟钝，精神萎靡，进食减少，1d后假手术组反应灵敏，精神恢复，进食增多。

2.2 HE染色 对照组神经元细胞变性、死亡少见，细胞形态基本正常，手术组白质内可见散发性神经纤维及髓鞘变性，神经元细胞很多变性、坏死，核浓缩，空泡变性。

2.3 GFAP、GAP－43的表达 （1）缺血再灌注组：GFAP阳性细胞3d后开始增加，7d后GFAP的反应至高峰，14～21 d后反应回落；GAP－43在12h表达升高，7d达到峰值，14d回落，21d表达稀少。（2）对照组：各指标变化规律与缺血再灌注组大致一样，表达较缺血再灌注组均低（P＜0.01）。

2.4 相关性分析 （1）缺血再灌注组：GFAP与GAP－43相关系数r＝0.911，P＝0.011＜0.05，差异有统计学意义，提示二者高度相关。（2）假手术组：GFAP与GAP－43相关系数r＝0.656，P＝0.158＞0.05，差异无统计学意义。

3 讨论

本研究中，手术组海马CA1区星形胶质细胞的突起变粗、胞体变大，GFAP阳性细胞数增加，与对照组比较差异有统计学意义（P＜0.01），提示脑缺血－再灌注后星形胶质细胞活化增生，且增生持久，对照组GFAP阳性细胞数显著减少。

研究显示仅在已分化定型且轴突生长的神经元中发现GAP－43的存在，且与神经元的胚胎起源无关，提示新生神经元的轴突生长、发育与GAP－43无相关性。一旦开始分化，GAP－43会大量出现在大鼠的胞体和初生突起中，提示GAP－43与神经发育密切相关。

星形胶质细胞可分泌Glial因子影响突触可塑性。Mauch等［1］发现，Glial因子是胆固醇与载脂蛋白E（ApoE）的复合体。胆固醇可通过增强突触素（synapsin）和突触泡膜素（synaptophysin）的生成，促进突触形成。有研究指出［2］，Glial释放的TNF－α可通过加快AMPA受体的表面表达提高突触效能。

中枢神经系统中的胆固醇源自星形胶质细胞中的原位合成胆固醇，为突触的生成提供原料，所以中枢神经系统中胆固醇摄取、运输或生成过程中每一环的功能缺失均可能损伤突触的发育和可塑性，故体内胆固醇或脂蛋白缺失或供应障碍，可出现神经行为异常［3］。

综上所述，GAP－43表达与星形胶质细胞密切相关。可通过干预星形胶质细胞加速神经突触形成，为临床治疗缺血性脑血管病提供新的思路。

［1］ Mauch DH，Nagler K，Sc humacher S，et al.CNS synaptogenesis promoted by gila－derived cholestero1［J］.Science，2001， 294：1 354－1 357.

［2］ Biattie EC，Stellwagen D，Morishita W，et al.Control of synaptic strength by glial TNF－α［J］.Science，2002，295：2 282－2 285.

［3］ 耿战辉，程义勇.重新认识神经胶质细胞［J］.生理科学进展，2003，34（3）：232.