DNA甲基化在结直肠癌早期诊断中的应用研究

马丽红 综述，唐彤宇审校

（吉林大学第一医院 胃肠内科，吉林 长春130021）

结直肠癌（CRC）是一种基因病，是常见的消化道恶性肿瘤。欧洲CRC发病率及死亡率居恶性肿瘤的第二位［1］。我国CRC发病率呈逐渐上升趋势［2］。由于饮食和生活习惯变化2007年全世界新增120万CRC病例中有60万人［3］死亡。目前常用诊断方法如粪便隐血试验（fecal occult blood test，FOBT）、结直肠镜检查、影像学检查等存在不足，甚至可导致肠道出血、穿孔、感染等并发症，限制了它们在CRC早期诊断中的应用，一旦确诊CRC多数已为进展期。近年来，表观遗传学机制受到人们的关注，并发现在肿瘤发生发展中DNA序列外的调控机制异常非常普遍［4］，因此DNA甲基化与肿瘤的关系成为研究热点。DNA异常甲基化作为肿瘤发生发展中的早期事件［5］，使其成为诊断治疗肿瘤的标志物。本文就特定基因甲基化在早期诊断CRC中的应用综述如下。

1 表观遗传学与DNA甲基化

表观遗传学是研究非基因核苷酸序列改变所导致的基因表达变化如DNA甲基化、组蛋白乙酰化、染色体重塑等［6］。研究结果表明，表观遗传学异常与肿瘤发生发展密切相关，特别是基因启动子区的异常甲基化导致的抑癌基因转录失活，影响着肿瘤发生发展的各个阶段［7］。

DNA甲基化是指在DNA甲基转移酶（DNA Methyltransferase，DNMT）的作用下，DNA的CG两个核苷酸的胞嘧啶被选择性的添加甲基形成5－甲基胞嘧啶的化学修饰过程［8］，DNA的不同甲基化状态（超甲基化与去甲基化）与基因的活性和功能有关。DNA甲基化转移酶有两种，持续性甲基化转移酶如DNMT1和另一种是重新甲基化转移酶如DNMT3a和DNMT3b，它们可以使去甲基化的CpG位点重新甲基化。甲基化位点可随DNA的复制而遗传给后代细胞［9，10］。DNA甲基化是发生在DNA复制之后的基因外修饰，不改变DNA的碱基序列，而是通过影响DNA的表达而改变其功能。在人类基因组中，Cp G常成簇存在，Cp G岛是碱基CG出现频率较高的区域，其常位于DNA的5’端启动子区，并且人类基因启动子60%以上包含在Cp G岛内。基因启动子区CpG岛异常甲基化导致基因转录失活，并通过有丝分裂传递这种后生性改变［11］。生理情况下，Cp G岛多呈非甲基化状态，大部分散在的Cp G二核苷酸则可为甲基化状态。

异常的基因甲基化可分为总体基因组的低甲基化和局部Cp G岛的高甲基化。异常的基因甲基化影响基因表达，进一步影响肿瘤发生与发展的各个环节，启动子区CpG岛高甲基化导致转录抑制，从而使抑癌基因失活，导致肿瘤发生发展。大量研究表明抑癌基因启动子区的CpG岛常出现高甲基化现象［12，13］。CpG岛甲基化在CRC中是一种常见的表观遗传改变，如大肠腺瘤息肉基因（APC）、6－甲基鸟嘌呤－DNA 甲 基 转 移 酶 （6－methylguanine－DNA methyltransferase，MGMT）、Ras相关区域家族1A（RASSF1A）等基因在CRC中发生Cp G岛甲基化，这些基因在细胞周期调节、信号转导、血管形成、DNA 修复 等方面发挥 重要功能［14－17］，甲基化使其表达异常，从而导致肿瘤的发生发展。

2 结直肠肿瘤的甲基化表现

2.1 总基因组的低甲基化 通过检测肿瘤中的5－mC，发现整个基因组甲基化水平很低，其中卫星DNA、重复序列和内含子中的Cp G位点的低甲基化可能与细胞增殖及细胞周期调控相关［18］，但总体基因组低甲基化的原因和作用机理尚不清楚。Chen等［19］报道当胚胎干细胞的DNMT出现纯合性缺失时，DNA出现的严重低甲基化（＞75%）使突变率大大提高，但这种程度的低甲基化是否在存在于CRC中，还有待进一步证实。

特定的癌基因在CRC中也出现低甲基化，使癌基因（如K－ras基因）表达水平提高。异常高表达的基因表现为低甲基化，说明低甲基化与肿瘤的发病机制有一定联系。研究表明，在细胞群体中，原本低甲基化的细胞形成肿瘤的趋势相对较大，基因低甲基化可能是导致肿瘤形成的祖先细胞克隆扩大的关键因素之一［20］。

2.2 局部CpG岛的高甲基化 和整个基因组低甲基化状态一样，基因启动子区Cp G岛的局部高甲基化也被认为是肿瘤发生发展过程中的早期事件，然而两者的发生机制一样亦或是来源于肿瘤发生中的不同机制［21］，目前的研究热点是抑癌基因启动子区的高甲基化，它是除基因突变外的另一种使基因转录失活的机制。Rb基因是第一个被研究证实与肿瘤相关的高甲基化基因，此后人们开始研究多种抑癌基因，并证实其启动子区的高甲基化状态与肿瘤的发生发展密切相关，如细胞周期依赖性激酶抑制基因（CDKN2A）、MGMT和上皮钙粘素（E－cadherin，CDHl）等。CRC的发生发展与很多基因的高甲基化有关，如抑癌基因、错配修复基因和细胞周期调节基因等。研究表明，DNA异常甲基化在肿瘤发生发展中的可逆性为从表观遗传角度治疗肿瘤提供了理论依据［22］。

3 基因甲基化在CRC早期诊断中的应用

DNA甲基化常发生在CRC的早期阶段和癌前病变如腺瘤中，故可作为CRC早期诊断的指标。正常肠黏膜每24h有l×1010～5×1010个上皮细胞脱落，鉴于肿瘤上皮细胞快速的更新速度，每天至少有1%的细胞脱落入肠道，随粪便排出体外。基因能在粪便内稳定存在，且持续脱落，故微量DNA是一种很好的标志物，并可通过扩增技术如聚合酶链反应（PCR）等检测出。并且鉴于粪便检查的无创性、无需肠道准备、肠道任意部位性，大大提高了CRC的检出率。尤其随着甲基化特异性PCR技术的进展，检测粪便中的DNA甲基化情况可作为筛查CRC的早期途径。目前国内外已经通过分析粪便基因来早期诊断CRC，Belshwa等［23］首先证实可把检测粪便DNA甲基化水平作为早期CRC筛查的有效途径，Muller等［24］的研究结果进一步证实粪便DNA甲基化检测用于CRC筛查的良好应用前景，并报道分析分泌性卷曲相关蛋白2（SFRP2）基因甲基化能够检出77%～90%的CRC。Lenhard［25］报道粪便肿瘤高甲基化基因分析诊断CRC的敏感性和特异性分别为42%、98%。黄朝晖、李莉华等［26］通过对不同人群CRC患者、结直肠腺瘤患者和正常对照者粪便中增生性息肉蛋白（HPPl）基因甲基化分析，得出HPPl基因甲基化是CRC发生发展中的早期事件并有望成为CRC早期诊断的新途径。程之红等［27］通过对CRC或良性病变的患者及24例正常对照者粪便SFRP2基因甲基化状态的分析，得出SFRP2基因甲基化是CRC发生发展过程中早期事件，并有望）成为CRC早期无创诊断的新途径。很多研究表明，粪便DNA甲基化检测可作为CRC早期诊断的一种新途径。

SFRP2是一种新的肿瘤抑制基因，在大多数CRC中表现出过甲基化［28，29］；Muller等［24］分析粪便 SFRP2基因甲基化水平检出77%～90%的CRC。目前国内研究CRC中SFRP2超甲基化发生率大于90%，对于无创性检测CRC具有高度的潜力［27，30］。SFRP2基因甲基化诊断CRC的敏感度最高，但特异度低，MGMT基因甲基化的特异度最高，敏感度低，因此，联合检测能提高诊断的敏感度，其特异度也略有降低。所以临床上需要筛选不同的基因组合用于粪便甲基化检测，以同时保证高水平的诊断敏感度及特异度［31］。

T淋巴细胞成熟相关蛋白（T－cell differentiation protein，MAL）基因定位于2q13，共含有4个外显子，其cDNA长为1051 bp。MAL是组成向顶端运输的细胞膜和分泌性蛋白的必不可少的组成部分。Guro等［32］的研究指出，在CRC中MAL基因启动子区甲基化率为80%，结直肠腺瘤为71%，正常上皮组织中为45%，在甲基化阳性的标本中，其蛋白不表达或表达明显降低。粪便中MAL、CDKN2A、MGMT基因启动子区甲基化水平在CRC和腺瘤患者中明显升高，其联合检测有望成为CRC及其癌前病变早期诊断的无创性检测方法［31，33］。

MGMT是一种DNA修复酶，基因定位于10q26，全长约为170kb，含有5个外显子和4个内含子，可以用其编码产物MGMT从DNA上移除烷化剂在06位形成的06－鸟嘌呤化合物，使存在DNA损伤的细胞停止增殖，恢复DNA的结构和功能，是机体抵抗烷化剂损伤的主要保护因素。研究表明，MGMT基因启动子的高甲基化是MGMT表达缺失的主要原因。消化系统直接接触烷化致癌物，因此MGMT失表达在消化系统肿瘤的发生发展过程中具有更为重要的意义。有研究显示，CRC中MGMT启动子区CpG岛的超甲基化，导致MGMT失表达，基因损伤修复失败，从而导致肿瘤的发生［34］。有研究表明，联合检测HPPl和MGMT基因甲基化对进展期腺瘤有较高的检出率（80%），对于早期发现和切除癌变前的腺瘤，降低CRC的发病率和死亡率具有重大的意义［31，35］。

4 结语与展望

CRC是常见的消化道恶性肿瘤之一，近年来其发病率、死亡率呈逐年上升趋势，并逐渐年轻化。目前DNA甲基化是CRC疾病发展过程中的重要环节，鉴于CRC发生发展是多因素、多基因、多途径共同作用的结果，且单个基因甲基化水平的敏感度不高，因此必须联合检测仅发生于结直肠肿瘤的多种基因的甲基化水平才可获得理想的敏感度与特异度。进一步研究DNA异常甲基化的机制，有助于结直肠癌的早期诊断，为结直肠癌的治疗开辟新的道路。

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