靳楷 迟放鲁
人类Corti器拥有多达16 000个毛细胞,分为1排内毛细胞(inner hair cell,IHC)和 3 排外毛细胞(outer hair cell,OHC),较宽的变化幅度能使人类感知到20~20 000 Hz频率的声音。Corti器具备精细感音能力的关键在于毛细胞、支持细胞,以及构成Corti器的附属细胞外基质等共同构成一个协调运转的功能整体[1]。每个毛细胞的顶表面有机械感受器纤毛束,由许多静纤毛组成。细胞外基质和耳蜗盖膜覆盖Corti器顶表面并与OHC静纤毛接触。毛细胞胞体与支持细胞构成紧密连接,依次在其基底面与另外一种细胞外基质(即基底膜)相黏附。近年来,在听觉感受器发育和功能的基因和分子机制研究方面取得很大进步,特别是耳聋相关基因和脊椎动物平面细胞极性(planar cell polarity,PCP)通路的研究大大推动了听觉细胞生物学的研究进程。
1.1 耳蜗毛细胞的细胞骨架 毛细胞的静纤毛按高度递减排开,最长的静纤毛和动纤毛并排。所有纤毛最高点指向远离胞体中心。这种极性对于毛细胞功能至关重要,纤毛束偏离方向引起机械传导通道开放是毛细胞功能发生的前提。动纤毛在发育过程中存在于纤毛束中,但在出生后退化。
细胞外肌丝将静纤毛和动纤毛整合成一个束支,并参与束支的被动机械运动。顶部连接在纤毛束机械敏感轴发出投射,并是门控静纤毛顶部的传导通道,纤毛束在顶部连接破坏时失去机械敏感性。与丝状伪足或细胞表面微绒毛类似,静纤毛由许多束均匀极化的肌丝所支撑,刺端指向静纤毛顶部。肌丝包含β肌动蛋白和γ肌动蛋白,并由espin、plastin1以及T-plastin交联(横向连接)。与丝状伪足或细胞表面微绒毛不同的是,静纤毛终身维持恒定长度。β肌动蛋白、γ肌动蛋白及espin在许多组织中都有表达,但当编码它们的基因突变时会显著影响纤毛束,证明静纤毛里不同肌动蛋白同工型及其交联剂的重要性。
静纤毛的肌动蛋白核心是动态变化的,肌动蛋白单体在静纤毛顶部组装上去并向胞体方向移动。为了维持静纤毛长度,肌动蛋白聚合与解聚速率必须严格协调。静纤毛的肌动蛋白周转率比丝状伪足慢10倍左右,提示其中有特异性机制来控制毛细胞的纤毛结构。
静纤毛的部分肌丝形成根丝,把静纤毛固定在特异性肌动蛋白网角平板上,原肌球蛋白和血影蛋白聚集在根丝周围并可能加固根丝。微管把角平板和轴向细胞骨架相连。有一肌动蛋白带附着在紧密黏附接头上,包绕角平板;细胞间的紧密黏附接头连接毛细胞和支持细胞。由血影蛋白交联的肌丝网构成OHC的侧质膜,并有助于维持它们的圆柱形态。
Morin等[2]使用酵母和哺乳动物成纤维细胞NIH3T3进行研究,发现在导致迟发型感音神经性聋DFNA20/26的2个γ肌动蛋白(ACTG1)相关突变体K118N和E241K中,其突变位点位于肌动蛋白解聚因子cofilin的结合位点上。为了检验该突变是否会增强cofilin敏感性,他们在聚合端加入cofilin后检验其化学当量对光散射范围的影响。电镜观察cofilin处理后E241K的肌动蛋白变化证实纤毛束消失及肌丝急剧缩短,这与cofilin剪切敏感性增强相吻合。于是提出ACTG1突变引起的该型迟发型感音神经性聋可能与毛细胞的细胞骨架进行性退化有关。
1.2 毛细胞纤毛束 纤毛束形态发生初始,每个毛细胞顶表覆盖微绒毛。这些微绒毛延长并形成相当长度的静纤毛。在此阶段,一根单独的动纤毛位于细胞顶表中间。随后动纤毛移至细胞边缘,邻近动纤毛的静纤毛开始由近及远依次伸长。然后,静纤毛停止生长,但附着肌丝增加宽度。中核肌丝在基底延伸形成根丝;静纤毛基底端形成锥形。最后,静纤毛再次开始伸长并生长至其最终长度。当纤毛束成熟时,部分毛细胞动纤毛已退化缺失。
基于形态学研究,动纤毛被认为对纤毛束极性发育非常重要。近年来对Bardet-Biedle综合征(Bardet-Biedle,BBS)相关基因的研究也支持了这种说法。与Bardet-Biedle综合征蛋白同源的小鼠突变体可引起纤毛束指向错乱。毛细胞鞭毛内和纤毛内转运蛋白Ift88的条件性失活也可引起动纤毛不发育及纤毛束错乱[3]。
毛细胞顶表的动纤毛运动是非随机的,但它的最终定位及纤毛极性在纤毛束原初极化后受到精细调控。控制动纤毛运动和纤毛束极性的分子还不清楚,极有可能是那些调控PCP的蛋白。PCP通路组分在毛细胞和支持细胞接头处非对称定位。PCP通路的突变体小鼠可表现出纤毛束的极性缺陷,因此研究者推测PCP组分通过调控细胞骨架相关运动蛋白来影响纤毛束极性。
2.1 纤毛内部肌动蛋白运转机制 在建立平面极性后,毛细胞静纤毛延长形成高度阶梯状的纤毛束。静纤毛长度可达100 μm,转运蛋白以极精细的方式将肌动蛋白及其调控因子转运至肌丝刺端。
肌球蛋白XVa是涉及静纤毛生长调控最早的蛋白之一,在此过程中它与改编蛋白whirlin合作。基因研究推测MYOXVA和whirlin之间存在联系,携带MYOXVA和whirlin突变基因者均患有耳聋;其种间同源基因突变体小鼠发生静纤毛缩短。MyosinXVa缺乏的小鼠毛细胞静纤毛顶部不再出现Whirlin,提示MYOXVA参与转运whirlin,whirlin结合膜相关胍裂解激酶(membrane-associated guanylate kinase,MAGUK)蛋白 p55 及蛋白4.1B(1种4.1R的同族物)。
松仁外层包裹的膜衣称为种籽衣。赵起越等[10]对红松种籽衣的各种营养成分进行了测定,证明种籽衣中含有丰富的多酚和黄酮类化合物。张根生等[11]优化红松种籽衣中多酚的提取工艺。苏晓雨等[12]对红松种籽衣提取物的抗氧化作用进行了评价,证明红松种籽衣提取物具有明显的抗氧化活性并认为其优良的抗氧化性与多酚及黄酮等活性成分相关。
肌球蛋白3a(myosin 3a,Myo3a)和espin的突变体能使人类产生耳聋,并且这2种蛋白均涉及静纤毛生长。Myo3a突变体小鼠并未描述,但espin突变体小鼠产生异常纤毛束。espin包含锚蛋白重复片段,为肌动蛋白单体、SH3区域、腺苷三磷酸及磷脂酰肌醇2提供结合位点,提示该蛋白对肌动蛋白装配起作用,而且espin过表达引起静纤毛延长。espin的同工型espin 1在静纤毛顶部形成套管状的帽子。Myo3a和espin共表达引起静纤毛更加伸长,提示Myo3a转运espin 1到静纤毛顶部,从而调控静纤毛长度。
Myo7a是涉及调控静纤毛长度的第3种动力蛋白。Myo7a突变体同样引起耳聋,在形态上发生纤毛束缺陷及过度伸长。在Myo7a缺乏情况下,肌动蛋白周转循环增加,提示Myo7a调节F肌动蛋白向后部流动。Myo7a可能也调控蛋白转运来限制肌动蛋白组装。一种候选“货物”蛋白 twinfilin 2,可结合Myo7a继而加帽和断裂肌丝。Myo7a缺陷小鼠中twinfilin不再靶向静纤毛顶部,并且过表达twinfilin 2减低静纤毛长度,建立了它与Myo7a的潜在功能联系。
whirlin和espin 1在纤毛束最长的静纤毛中表达更强;twinfilin2在最短的静纤毛含量更多。whirlin、espin 1、twinfilin 2以及Myosin XVa等其他肌动蛋白结合蛋白的相对表达水平可能最终决定静纤毛长度[4]。近年来有研究者[5]提出假设:PCP通路决定了这些蛋白在纤毛束中的级联分布。
2.2 肌动蛋白解聚作用及调节 ADF/cofilin家族由3个高度相似的种内同源基因(编码蛋白)组成:cofilin-1(cfl1,非肌型cofilin,n-cofilin)、cofilin-2(cfl2,肌型 cofilin,m-cofilin)及肌动蛋白解聚因子(actin depolymerizing factor,ADF)。这3个同工型的相对表达水平和在小鼠上记录的一样,都因细胞或组织特异性而不同。在发育过程中,cfl1在成熟组织中广泛表达。ADF在出生后得到上调,主要存在于上皮和内皮组织,通常浓度低于cfl1。在胚胎形成晚期和出生后,cfl2在横纹肌中取代cfl1,成为在已分化的骨骼肌中唯一存在的同工型,是心肌中主要的同工型[6]。
cfl1下调可被ADF表达所挽回,反之亦然。相比之下,在更加复杂的条件,比如在特异性发育或者生理过程中,不同cofilin/ADF同工型表现截然不同的作用。值得强调的是,cfl-/-小鼠无法存活,但ADF-/-小鼠可以。即使对cfl-/-上调ADF,虽能度过原肠胚形成期,仍在E9.5后死去。在这种发育阶段,cfl1对于来自神经外胚层或轴旁中胚层特异性细胞系的细胞迁移事件非常重要。最近通过脑特异性敲除研究发现,cfl1重点控制大脑皮质的细胞迁移和细胞周期进展。相比之下,ADF-/-小鼠表现出相对正常的胚胎发育,提示ADF缺陷可由cfl1弥补。然而,出生后不久ADF-/-小鼠角膜上皮异常增厚并变盲。即使上调 cfl,ADF缺陷的角膜细胞具有高度异常水平的F肌动蛋白。
ADF/cofilins由Ser3磷酸化而失活。这种翻译后修饰可引起G肌动蛋白和F肌动蛋白的抑制及剪切。携带S3D/E和S3A置换的突变体已在体内成功用于分别模拟非活性磷酸化ADF/cofilin和活性ADF/cofilin。2个具有相关催化域的普遍酶对cofilins磷酸化失活起作用:LIM激酶和睾丸激酶。Slingshot家族的磷酸酶(PPases)和卤酸脱卤酶磷酸酶(chronophin)可使磷酸化ADF/cofilin复活。本身作为小Rho GTP酶下游激活型,已报道是肌动蛋白细胞骨架重组GTP酶下游的必要调节因子,并涉及Rac-依赖性板状伪足的形成以及Rho-依赖性压力纤维和焦点黏附的形成。最近研究表明,LIM激酶1和激酶2的同工型部分受到不同控制。Rho和Cdc42信号通过 Rho激酶ROCK I和ROCK II以及肌强直性营养不良激酶相关CDC42结合激酶MRCKα都传至LIM激酶1和激酶2。PAK1和PAK4,Rac激活的下游,也能活化 LIM激酶1,但不能活化激酶2。Rac-PAK2激活通路目前也被描述,但未分析PAK2是否显示LIM激酶同工型特异性[7]。
另外,也发生GTP酶依赖性LIM激酶活化过程。例如钙-整合素结合蛋白1(CIB1)活化 LIM激酶1,由纤连蛋白(fibronectin,FN)黏附或LIM激酶1磷酸化诱导,内皮细胞中血管内皮生长因子下游由MAPKAPK激酶活化。相比Rho GTP酶依赖性激酶,MAPKAPK激酶在PDZ域丝氨酸残基磷酸化LIM激酶1,并且这种磷酸化作用被认为在LIM激酶的氨基末端与激酶区域之间释放一种自发抑制作用。去磷酸化和灭活LIM激酶1和激酶2的磷酸激酶是SSH1L,它也可以去磷酸化cofilin,提示通过同时存在cofilin活化和LIM激酶抑制的正反馈环。影响睾丸激酶活性的通路非常不同,主要由整合素介导并有黏附依赖性。睾丸激酶1活性由α-parvin(或actopaxin,1种聚焦黏附蛋白/黏附斑蛋白)隔离或14-3-3β(结合磷酸丝氨酸/苏氨酸模块的支架蛋白大家族的一员)而抑制,这种抑制在FN-整合素衔接时减轻。
3.1 PCP效应蛋白与纤毛极性形成 Inturned和Fuzzy是最早被提出参与PCP信号传导和纤毛组装的蛋白,属于PCP效应蛋白,它们在果蝇翅膀PCP信号传导中起关键作用。在爪蟾纤毛组织中也有高度表达,特异性基因敲减可引起纤毛形成和Hedgehog信号传导缺陷,提示小鼠纤毛形成和Hh信号传导也需要这些蛋白的参与。Inturned编码1个含PDZ的蛋白,功能作用在核心PCP蛋白下游,控制果蝇体毛和鬃毛的平面极性。
Fuzzy也编码1种新蛋白,在果蝇体内其功能不明。对于脊椎动物而言,多种分析推测它的功能跟囊泡流动有关。与inturned不同的是,Fuzzy不是基体系泊所必需的,但对轴丝延长所需。Fuzzy和类RabGTPase(RSG1)一起作用,控制从胞质到基体以及从基体到纤毛顶的流动[10]。Fuzzy怎样与其他纤毛流动系统(如BBSome和IFT)发生联系仍然是一个重要问题,而且Fuzzy和Ift20都参与和纤毛形成不相关的胞吐作用。
还有一个重要问题:Inturned和Fuzzy在果蝇翅毛的平面极性的作用已经明确,但它们在脊椎动物PCP中怎样控制发育进程(如汇聚伸展)仍然不清楚。此外,虽在Fuz突变小鼠表皮发现广泛Hh相关缺陷,但毛囊的平面极性并不受影响,不像那些重要PCP基因突变所导致的那样[11]。
现在已知PCP信号传导和经典Wnt信号传导存在许多相同组分,Wnt与Fz受体及共受体结合可引起β-catenin稳定并向核移位从而进行转录调控。但与经典Wnt信号传导通路不同的是,PCP信号传导直接针对下游细胞骨架重排,因此称为“非经典”Wnt通路。在爪蟾和细胞培养中已被确认的下游效应器包括人们熟知的细胞骨架、细胞极性以及突出活性的调控因子,如Rac、RhoA、Cdc42、JNK/SAPK 样激酶、Daam1。此外,Inturned、Fuzzy和Dub作为下游PCP效应蛋白在爪蟾和斑马鱼的汇聚伸展中是必需的,但它们在内耳中的功能还未得以证实。
3.2 核心PCP蛋白与纤毛形成 目前,PCP效应蛋白在纤毛形成中的作用已获得证实,核心PCP蛋白在纤毛形成中的作用更为复杂。对于它们功能的最早研究来自斑马鱼,Cap-Zip肌动蛋白调控子Duboraya被发现介导PCP信号传导并控制纤毛形成。Oishi等继续发现操纵Frizzled或Dvl引起Kupffer囊泡发生错误的纤毛形成。其后,Dvl被发现控制爪蟾表皮多纤毛细胞的纤毛形成,Dvl是顶部肌动蛋白组装、Rho活性、基体系泊的必要因素。值得注意的是,Duboraya也在纤毛细胞的顶部肌动蛋白组装过程中所需要。基体系泊涉及初生基体和膜结合囊泡的联合,最近研究发现在纤毛形成过程中囊泡栓出胞外复合体。Dvl在该水平控制基体系泊,Dvl受干扰后基体失去与囊泡或胞外复合体的联系。
人们猜测Dvl和纤毛形成之间存在联系得益于人类基因学的研究。人们发现在 Meckels综合征(Meckels syndrome,MKS)和Joubert综合征(Joubert syndrome,JSRD)中发生4次跨膜蛋白TMEM216的突变。TMEM216定位在基体与中心体,敲减它会导致基体系泊和纤毛形成的障碍。TMEM216与另外MKS蛋白Meckelin(TMEM67)相互作用,敲减任意1个都引起RhoA的过度激活和Dvl的磷酸化。Dvl情况仍需进一步调查。最近研究清楚阐释了纤毛形成中需要另外的核心PCP蛋白。小鼠与果蝇Starry Night/Flamingo的同源基因(Celsr2和Celsr3)突变体在脑的多纤毛室管膜细胞表现出严重的纤毛形成缺陷。缺乏Celsr2和Celsr3的小鼠,其室管膜细胞分化正常但没有或极少形成纤毛,小鼠Celsr突变体的纤毛缺陷由顶部质膜缺乏基体系泊造成。最近研究支持了Prickle在调控纤毛长度方面的可能作用[12]。
一些核心PCP蛋白在纤毛形成中起作用,至少在某些细胞型纤毛发生需要“PCP通路”。爪蟾体内Vangl2敲减可导致基体定位和纤毛形成中断。应该注意的是,Vangl敲减并不完全消除纤毛但能减少基体数量。小鼠Vangl1和Vangl2突变体不引起多纤毛气道细胞、神经管或培养MEFs的纤毛形成缺陷。但有研究者通过斑马鱼研究报道,Vangl2突变体胚胎在Kupffer囊泡细胞、前肾多纤毛细胞或早期神经管的单纤毛足板细胞不表现纤毛形成缺陷。另有报道称,这些突变体鱼表现为纤毛数目减少,并且基体不在顶部定位[11]。
因此,核心PCP基因在纤毛形成过程中相当复杂;但清楚的是,核心PCP组分的不对称定位受到关注,这些PCP蛋白必需首先在顶部定位,随后顶-底极性蛋白Scribble与PCP蛋白在功能和结构上相互作用。有人会想,PCP组分最初的顶部定位可被细胞用来介导基体的顶部定位,这是否代表PCP通路的新观点或者仅仅是具备多种细胞功能的单个PCP蛋白所引起的,还需要进一步研究加以确定。
3.3 毛细胞纤毛极性发育 Corti器上皮和前庭上皮都有顶表面,上面1根富含微管的原纤毛(动纤毛)由中心体或基体参与成核。原纤毛的产生和维持有赖于鞭毛内转运(IFT)蛋白复合体。长期以来人们揣测动纤毛活动引导了纤毛束的极化。支持观点有:①耳蜗纤毛束固有极性明显由动纤毛位置所标记,在V-形静纤毛的顶点;②毛细胞发育过程中,动纤毛极化早于静纤毛束的极化;③动纤毛的短暂出现提示具有发育作用。
最早提示哺乳动物内耳发育中原纤毛和PCP调控存在联系的证据来自于BBS突变小鼠。BBS许多基因与纤毛/基体组装以及功能有关。BBS缺陷小鼠表现出静纤毛异常形态,动纤毛与静纤毛紧密联系丧失。Vangl2和BBS基因同时突变的小鼠表现出耳蜗形态更为严重的缺陷。研究表明,动纤毛在PCP信号传导中作用明确。在Ift88纤毛突变体中,Corti器变得更短并且更宽,毛细胞定向紊乱,即使核心PCP蛋白不对称定位未受影响。此外,Ift88突变体中,静纤毛束呈环状,动纤毛更短并且不再与静纤毛最高点紧密联系。Ift88突变小鼠的核心PCP蛋白是正常的,说明细胞-细胞通讯是正常的;但是对信号的反应出现问题,该信号产生于核心PCP蛋白的非对称分布。Ift88CKO和Vangl2Lp联合突变体表现为更为严重的纤毛束错乱以及耳蜗伸展障碍,证实核心PCP蛋白和纤毛形成通路之间存在相互作用,但这种基因相互联系的分子特性还未知。爪蟾和体外细胞培养的诸多研究[13-14]指出,肌动蛋白及微管-细胞骨架网与纤毛形成存在直接联系。纤毛研究进一步发现,在PCP信号传导过程中原纤毛基体对决定固有极性起关键作用,沿耳蜗毛细胞平面极性轴发现有一对中心体。在Ift88突变体小鼠,纤毛束指向一个大致的方向(错位基体的方向),强烈提示:①IFT88/纤毛功能对基体定位是必需的;②基体位置参与决定纤毛束方向。
基体可能一定程度上参与核心PCP蛋白的不对称分布模式,并将其传达至细胞骨架,进而以细胞环境依赖性方式指导纤毛束极性形成[15-16]。要研究动纤毛和纤毛束极性形成,首先应弄清楚两者的物理和生化关系。Usher综合征小鼠模型的基因研究确立了部分建构毛细胞纤毛束的分子机制。携带USH突变体基因的小鼠,表现非常明显的纤毛束缺陷,与纤毛突变体表型极为相似。USH突变体小鼠具有纤毛群,表现为环状纤毛束、纤毛束中动纤毛移位。考虑到USH蛋白在纤毛束形成中对肌动蛋白细胞骨架的重要作用,以及基体在微管细胞骨架(共存并直接与肌动蛋白细胞骨架相联系)的作用,人们猜测基体作为结构中心来定向细胞及纤毛微管,并且提出一种协调参与极化纤毛束形态发生的USH蛋白活性构架。此外,USH蛋白还可能与核心PCP蛋白复合体相互作用,向基体反馈信息,从而协调Corti器细胞的极性。然而,目前尚缺乏支持这种模型的分子细胞学依据(USH蛋白与核心PCP蛋白以及USH蛋白与基体之间相互调节的依据)[17]。
耳聋相关基因的研究极大地推动了耳蜗毛细胞分子细胞生物学的发展。Myosin动力蛋白是听毛细胞的功能核心,它们控制细胞内各种加工处理过程,如蛋白转运以及机械转导通道的激活。肌动蛋白的动态变化对于耳蜗毛细胞机械转导以及极性发育也具有重要作用。脊椎动物PCP信号传导模型提出了很多关键问题。然而,核心PCP蛋白相互作用及核心PCP蛋白和原纤毛或基体之间的联系还不清楚;激活影响细胞形态和极化结构形成的细胞骨架机制的下游通路还不明白;PCP信号传导在Corti器发育汇聚伸展中的机制还不完全明确。随着研究方法及思路的不断进步以及更加深入地认识内耳感受器的形态发生及听觉机制,相信在不久的将来会逐步解开这些谜团。
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