Nrf 2－ARE通路对心肌缺血再灌注损伤的保护作用＊

李小娟(综述)，王海英(审校)

(遵义医学院 麻醉系，贵州遵义 563099)

心肌缺血再灌注损伤(myocardial ischemia re perfusion injury，MIRI)是临床医生面临的一大难题，尤其是随着溶栓法、介入手术、冠脉搭桥、心脏移植等治疗手段的开展，MIRI问题拭待解决。据统计因为MIRI导致患者死亡或心力衰竭的发生率分别为10%、25%。缺血后再灌注期过量产生的活性氧(reactive oxygen species，ROS)导致氧化应激，氧化应激与MIRI的发生密切相关［1］。而转录因子NF－E2相关因子2(Nuclear factor erythroid2－related factor 2，Nrf 2)－抗氧化反应元件(antioxidant response element，ARE)通路是目前为止发现的最为重要的内源性抗氧化应激通路，在心血管系统中的分布非常广泛，诱导激活后可上调内源性抗氧化系统，从而减轻心肌的氧化损伤。同时Nrf 2是氧化应激的感受器，在参与细胞调节抗氧化应激中发挥关键作用，是抗氧化应激的重要转录因子。ARE对抗氧化应激有其独特的诱导机制，作为顺式作用元件，可与过氧化氢(H2O2)、ROS和亲电子基团等外来化合物共同诱导抗氧化基因的表达。因此，研究Nrf 2－ARE通路对MIRI的保护作用在临床上具有广阔的应用前景及经济效益。本文以Nrf 2－ARE通路与心肌缺血再灌注损伤的最新研究进展作一综述。

1 Nrf 2－ARE的基本结构

1．1 Nrf 2 Nrf 2是Moi等1994年在克隆实验中发现的一种分子量为66000的新蛋白，含有一个基本的亮氨酸结构域，几乎在各种细胞内都可表达。Nrf 2属于CNC转录因子家族，由bZIP、碱性区、酸性区、cap＇n＇collar区 4 个区组成，有 6 个高度保守的结构域为Neh1至Neh6。

1．2 ARE ARE在生物体内的分布广泛，是机体内非常重要的抗氧化应激反应元件。ARE在Ⅱ相代谢酶基因启动子5’端调控区，其核心序列(或称共有序列)为5’2 TGACnnnGC2 3’，这一特殊的DNA启动结合区域是诱导Ⅱ相代谢酶和亲电子物质转录活化所必需的，其5’端基因在激活后能诱导产生大量的保护性基因，转录因子Nrf 2转位进入细胞核，Nrf 2首先和肌腱纤维瘤蛋白(muscle aponeurotic fibrosarcoma protein，Maf)以异二聚体的形式结合，然后该异二聚体再与ARE或亲电子物反应元件(EpRE)结合，从而启动二相酶基因的转录。上调一系列酶诸如:谷胱甘肽、谷胱甘肽还原酶(GR)、过氧化氢酶(CAT)、谷胱甘肽过氧化物酶(GPx)、谷胱甘肽S转移酶(GST)、醌氧化还原酶1(NQO1)、血红素加氧酶1(HO－1)、谷胱甘肽半胱氨酸合成酶(GCL)等抗氧化酶及Ⅱ相解毒酶的表达［2，3］。进而抵抗各种内外源刺激对机体产生的氧化应激和损伤。

2 Keap1与Nrf 2的激活

2．1 Keap1与 Nrf 2的稳定性 90年代末期，Yamamoto等发现在诱导信号传递给细胞核内ARE的过程中，两种信号蛋白质参与了传递，一种是Nrf 2，另一种是Keap1。Keap1是相对分子量为69000的蛋白质，在胞浆中锚定于肌动蛋白细胞骨架上。Keap1的IVR区参与泛素化连接酶形成，亲电化合物及氧化剂与Keap1的反应发生在插入区IVR，所以与Nrf 2稳定性有关［4］。有研究报道，未受诱导的细胞内生的Nrf 2消除很快，其半衰期约为20 min。目前，对于Nrf 2与Keap1的关系多数学者的观点是:生理状态下，Keap1在细胞质内以二聚体的形式结合一个Nrf 2分子，将其控制在胞浆中，这样，Nrf 2处于非游离并不断降解的非活性状态，使保护细胞的酶类和抗氧化物处于基础表达水平。当胞浆中的Nrf 2被释放出来，且与泛素脱离，其稳定性就明显提高。但这并不是说游离的Nrf 2就不降解，只是其降解的速度明显减慢［5］。

2．2 Nrf 2的激活及核转位 目前大多数观点认为，Nrf 2的活性主要由Keap1负性调节。Nrf 2的激活即Nrf 2与Keap1的解离可在以下两种情况下发生:一是当受到亲电试剂或ROS的攻击时Keap1中的巯基改变;二是通过蛋白激酶C(PKC)途径使Nrf 2磷酸化，Nrf 2和Keap1解离后Nrf 2转位进入细胞核，与ARE元件识别并结合，从而启动下游Ⅱ相解毒酶等保护性基因的转录，提高细胞的抵抗氧化应激的能力。最近有研究发现使用活性氧及氮族化合物处理细胞后，Keap1分子内部通过Cys151形成了二硫键，继而激活Nrf 2，使Nrf 2与Keap1解离，核转位进入细胞核［6］。但具体由何种激酶激活取决于相应的刺激因素及细胞类型。

2．3 Nrf 2的降解 细胞的氧化－还原平衡一旦恢复，Nrf 2与ARE元件解离，输出到胞浆，通过E3泛素连接酶泛素化后降解，关闭Nrf 2通路，重新维持低基础水平的Nrf 2。

3 MIRI与氧化应激

MIRI是指在组织器官缺血恢复血流后，其细胞代谢功能障碍及结构破坏反而加重、甚至发生不可逆损伤的现象。IRI的始动因素是缺血缺氧，包括缺血期的原发性损伤和再灌注期的继发性损伤。1960年Jennings等人首次提出MIRI以来，到现在MIRI的病理生理机制还未完全阐明，其发病机制可能与氧自由基、钙超载、炎症反应、细胞凋亡、蛋白激酶途径等有关［7，8］。再灌注期过量产生的ROS介导产生的氧化应激是导致MIRI的主要机制，采用外源性自由基清除剂可减轻心肌损伤［9，10］。ROS是双刃剑，虽然ROS低浓度时在正常的细胞代谢和信号转导中充当介质具有重要作用，但较高浓度的ROS对细胞有害。有研究报道，ROS不但能够引起急性缺血期损伤，在再灌注期，与炎性反应介质释放和白细胞浸润密切相关的ROS会进一步加重急性缺血损伤。也有研究表明，大量ROS可抑制线粒体的氧化磷酸化，使能量合成不足;在心肌再灌注的早期，氧自由基的释放及抗氧化酶活性降低，可导致心肌细胞严重受损，而ROS的清除和调整因子能够增强内源性抗氧化系统的作用，对抗IRI。因此，及早有效地进行抗氧化应激治疗，清除ROS，可明显减轻MIRI并改善心功能状态。综上所述，氧化应激在MIRI的发生中起着关键性的作用，寻找调控氧化应激的靶点将为对抗MIRI开辟新的道路。

4 Nrf 2－ARE通路、氧化应激、MIRI的关系

4．1 Nrf 2－ARE通路与氧化应激 细胞受外源性或内源性氧化应激刺激后，Nrf 2活化从Keap1解离后进入细胞核，在核内与Maf蛋白结合成异二聚体后识别并结合ARE，进而启动受ARE调控的基因的转录［11］，提高抗氧化损伤能力，这一路径即为Nrf 2－ARE通路。氧自由基及相关代谢产物过量聚集，超过机体代偿能力，导致体内的氧化系统和抗氧化系统平衡状态破坏，进而引起脂质过氧化，最终引起细胞代谢障碍，直接或间接干扰细胞DNA、蛋白质和脂质等生物大分子的生理功能，对机体细胞造成损伤，即氧化应激损伤。

Nrf 2－ARE通路是内源性抗氧化应答机制中最为重要的信号通路之一，处于氧化应激的中心地位。其作用通过以下方式发挥，氧化应激期间，一方面，氧化应激可加速 Nrf 2的mRNA转录，增加Nrf 2蛋白合成，另一方面，氧化应激导致Keap1－Nrf 2复合体解离，使游离的Nrf 2增加，进入细胞核内的Nrf 2增加，然后通过上调其下游抗氧化蛋白及二项解毒酶基因的表达从而减轻氧化损伤［12］。所以，ARE的激活是Nrf 2－ARE通路调节细胞抗氧化应激的关键，研究表明，采用转染了pGL4－ARE重组质粒的HEK－293细胞来研究白藜芦醇抗氧化作用的机制发现，白藜芦醇可明显激活Nrf 2－ARE通路，上调Nrf 2水平，过量的Nrf 2由胞质转移入核内，与ARE结合，启动下游基因表达，提高抗氧化酶GST和SOD的活性，从而实现其抗氧化应激作用［13］。研究发现多种抗氧化剂均通过Nrf 2－ARE通路发挥抗氧化作用，如金丝桃苷可通过Nrf 2－ARE通路介导抗氧化蛋白HO－1表达提高，减轻氧化损伤［14］。

到目前为止，已证实经Nrf 2－ARE信号途径调节的内源性保护基因超过200个，主要包括3大类:(1)细胞内氧化还原基因，如HO－1;(2)Ⅱ相解毒基因，如谷胱甘肽－S转移酶和醌氧化还原酶－1(NQO－1)等;(3)编码转运蛋白的基因，如多药耐药蛋白(MRP)等［15］。有研究认为，通过Nrf 2途径上调血管内皮细胞、血管平滑肌细胞、心肌细胞等Ⅱ项解毒酶及抗氧化蛋白的表达，可减轻大量氧自由基造成的心血管系统的急慢性损伤［16］。抗氧化酶类主要通过催化自由基转化为无毒物质和增加其水溶性而使自由基排除，达到维持机体氧化还原平衡的目的［17］。Nrf 2基因敲除小鼠对线粒体应激及缺血的敏感性明显增加，也提示Nrf 2－ARE通路是调节细胞内氧化应激的关键。Nrf 2基因敲除后发现，大鼠体内包括过氧化氢酶、谷胱甘肽－S－转移酶、NQO－1、HO－1、谷胱甘肽过氧化物、谷胱甘肽、谷胱甘肽还原酶、SOD1等表达降低，增加了对氧化应激的敏感性［18］。

4．2 Nrf 2－ARE通路对MIRI的保护作用 目前缺血性心脏病的发病率处于原发性心脏病首位，其中心肌缺血再灌注损伤约占50%以上。近年发现的Nrf 2在心血管系统具有稳定的表达，大量研究证实Nrf 2－ARE通路在MIRI中发挥重要保护作用。尽管目前对Nrf 2－ARE通路对MIRI具体的保护机制学说众说纷纭，通过减少ROS抗氧化应激损伤、减轻钙超载、抗炎症、抗心肌细胞凋亡等，各机制相互联系，相互渗透，抗氧化应激学说目前研究最为广泛。实验证明，多种药物通过Nrf 2－ARE通路介导抗心肌缺血再灌注损伤保护作用。研究表明大量的醛类物质堆积是导致缺血再灌注损伤的主要原因。Zhan等［19］的研究发现5mol/L的4－羟基壬烯醛预处理可通过激活Nrf 2表达和刺激谷胱甘肽的生物合成来使心肌细胞对4－羟基壬烯醛的细胞毒性产生耐受作用，减轻IRI引起的心肌细胞损伤。同时，有研究显示，由细胞因子TNF－A刺激产生的ROS广泛参与各种缺血性心肌损伤的病理生理过程，TNF－A能激活Nrf 2，升高谷胱甘肽的浓度，通过Nrf 2－ARE通路介导对HL－1心肌细胞的保护作用［20］。

朱晓洁等［21］利用钴原卟啉预处理缺氧/复氧H9C2心肌细胞，并用抑制剂分别抑制HO－1及Nrf 2－ARE，检测细胞上清液中乳酸脱氢酶(LDH)、胆碱激酶(CK)的水平变化，同时采用Western blot分析HO－1、Nrf 2的蛋白表达水平，RT－PCR法分析HO－1mRNA表达水平，结果表明钴原卟啉预处理通过诱导H9C2心肌细胞HO－1过表达发挥对缺氧/复氧损伤心肌细胞的保护作用，其保护作用机制与Nrf 2－ARE通路相关。Li等［22］的研究也发现，美国西洋参可抑制双氧水诱导H9C2心肌细胞的损伤，也是通过激活Nrf 2通路发挥作用。

Nrf 2及其调控的下游抗氧化基因参与了MIRI的保护机制。研究显示，敲除Nrf 2基因的小鼠细胞内抗氧化剂及二相酶的基态表达远远低于正常小鼠，对ROS引起的细胞毒性敏感性增加，说明抗氧化基因对保护氧化性心肌损伤至关重要，Nrf 2的表达参与了成纤维细胞中抗氧化剂和二相酶的表达和诱导，Nrf 2基因敲除提高成纤维细胞对ROS引起的细胞损伤的敏感性［23］。综上所述，氧化应激是导致IRI的关键因素，而Nrf 2－ARE通路可有效抑制氧化应激，说明通过Nrf 2－ARE通路调控氧化应激来对抗MIRI具有重要意义。

5 展望

20世纪90年代发现Nrf 2转录因子以来，各领域对其展开了广泛地研究，Nrf 2－ARE通路作为内源性抗氧化系统，可有效抑制氧化应激。在心血管系统，目前主要集中在Nrf 2－ARE通路抗MIRI机制的研究，本课题组在既往对缺血预处理、药物预处理、抗心肌缺血再灌注炎性反应的基础上，以Nrf 2为靶点，从细胞分子水平揭示后处理心肌保护作用的机制及Nrf 2－ARE通路的激活机制。随着对Nrf 2－ARE通路在抗MIRI方面作用的认识及其作用机制的更深一步了解，开发调控Nrf 2－ARE通路为靶点的药物在临床抗心肌缺血再灌注损伤的预防和治疗中具有很好的应用前景。

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