人参皂苷Rg3对HT-29细胞株MMP-9和TIMP-1表达的影响

杜卫东，屠巍巍，孙 传

浙江中医药大学附属第一医院普外科（杭州 310006）

基质金属蛋白酶-9（matrix metalloproteinase-9，MMP-9）是一种依赖金属锌离子的金属酶，是基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinases，MMPs)家族中的一员，属于明胶酶，它可以选择性地降解细胞外基质。MMP-9 的活性可被组织金属蛋白酶抑制因子-1（tissue inhibitor metalloproteins-1，TIMP-1）所抑制。MMP-9与TIMP-1的表达失去平衡在肿瘤的侵袭和转移过程中起着关键性的作用。人参皂苷Rg3 有多种抗肿瘤机制，本实验旨在研究人参皂苷Rg3 可否通过改变HT-29 细胞MMP-9 mRNA 和TIMP-1 mRNA的表达，从而发挥抗肿瘤浸润转移的作用。

1 材料与方法

1.1 主要药物 人参皂甙Rg3 纯品购于大连富生天然药物开发研究所，规格20 mg/瓶，纯度为99.39%。

1.2 细胞株 HT-29细胞购于上海生命科学院。

1.3 试剂及仪器 RNA 提取试剂盒，MMP-1、β-actin引物均由上海生工提供。逆转录试剂盒购自Fermentas 公司。Taq DNA 聚合酶购于上海Promega 公司。DL2000bp DNA Marker 购于上海Promega 公司。ABI 公司PCR 仪，Bio-Rad 公司凝胶图像分析系统扫描条带灰度，Quantity One v4.6.2软件分析。

1.4 方法

1.4.1 细胞培养及处理 HT-29 细胞在含10%胎牛血清，青霉素100 U/mL，链霉素100 μg/mL 的DMEM 培养液，5%CO2，37 ℃及饱和湿度条件下培养。当细胞处于对数生长期时，弃去培养液，用PBS液洗涤细胞,加适量0.25%胰蛋白酶液消化细胞后，制成细胞悬液。人参皂苷Rg3 以DMSO 助溶，配成工作浓度2 μg/mL，以0.22 μm抽滤。以2×105个细胞的密度铺于24孔板，分为4组：人参皂甙Rg3高剂量组（100 μg/mL）、中剂量组（50 μg/mL）、低剂量组（25 μg/mL）和空白对照组。对照组加10%胎牛血清的DMEM 培养液及同体积溶剂培养（DMSO 浓度＜0.1%）。培养24 h、48 h、72 h 后，收集细胞用Trizol 裂解，总RNA 提取按上海生工提供的RNA 提取试剂盒说明进行，用OD260/OD280鉴定RNA 纯度，1%琼脂电泳鉴定完整性。

1.4.2 RT-PCR 实验 取2 μg 总RNA，按试剂盒说明进行RT-PCR。MMP-9 的引物序列为5'TCA GGGAGACGCCCATTT3'（上游）和5'TCAGCTCGG GTCGGGGCA3（下游），PCR 产物长408 bp；TIMP-1引物序列为5'AATCAACGACACCACTTA3'（上游）和5'TGAAACGAACGGACGGTG3'（下游），PCR 产物长419 bp；β-actin 引物序列为5’GATGCAGAAGGA GATCACTG3’（上 游）和5’TAGTCCGCCTAGAAG CATTTG 3’（下游），PCR 产物长207 bp。PCR 体系为：cDNA 4 μL，上下游引物各2 μL，dNTP(2 mM) 4 μL，10×PCR buffer 4 μL，Taq酶（2 U/μL）1 μL，反应总体系为40 μL。反应条件为：94 ℃变性2 min,94 ℃变性1 min，55 ℃退火1 min，72 ℃延伸1 min，72 ℃终延伸10 min，30 循环。产物-20 ℃保存。PCR 产物于3%琼脂糖凝胶电泳，凝胶图像分析系统，扫描其灰度并定值。MMP-9 条带灰度/β-actin条带灰度、TIMP-1条带灰度/β-actin条带灰度分别表示其相对表达量，实验设平行孔，重复3次。

1.4.3 MTT法测定人参皂苷Rg3对HT-29结肠癌细胞的抑制率 每孔加入5 mg/mL的MTT 20 μL,继续培养4 h，弃去全部上清，每孔加入150 μLDMSO，微型振荡器振荡5～10 min使结晶完全溶解，在酶联仪波长570 nm 处测出用药后24、48、72 h 各孔吸光度值（A）。实验共重复3次，按下列公式计算细胞生长抑制率：抑制率（IR）=（1-实验组A/对照组A）×100%。

1.5 统计分析 实验设平行孔，重复3次，结果用均数±标准差(±s)表示，统计采用SPSS 14.0软件包，析因方差分析，多重比较。以P ＜0.05 为差异有显著性意义。

2 结果

2.1 人参皂苷Rg3 对MMP-9 mRNA 表达的影响

PCR 扩增产物经3%琼脂糖电泳可看到与目的片段大小一致的电泳条带。β-actin 片段为207 bp，MMP-9片段为408 bp（图1）。

图1 各剂量人参皂苷Rg3及对照培养HT-29细胞24 h后MMP-9 mRNA表达

经不同浓度Rg3 处理后，不同时间点MMP-9 mRNA表达见表1。

表1 不同时间组各浓度Rg3处理后MMP-9 mRNA相对表达量（μg/mL，±s）

表1 不同时间组各浓度Rg3处理后MMP-9 mRNA相对表达量（μg/mL，±s）

注：与0 μg/mL组比较，aP＜0.05；与0 μg/mL组比较，aaP＜0.01

0 25 50 100 n3333 24 h 0.271±0.004 0.273±0.002 0.280±0.004 0.242±0.004aa 48 h 0.311±0.002 0.294±0.002a 0.276±0.002aa 0.236±0.002aa 72 h 0.343±0.005 0.300±0.005aa 0.257±0.002aa 0.218±0.002aa

实验结果显示，24 h 组：高剂量组与对照组相比，有显著的统计学差异（P ＜0.01）；48 h 组：对照组与低、中、高剂量组相比均有显著的统计学差异（P ＜0.05、P ＜0.01、P ＜0.01）；72 h 组：对照组与低、中、高剂量组相比均有显著的统计学差异（P ＜0.01）。低剂量组：24 h组与48 h、72 h组相比，随时间延长,MMP-9 mRNA 表达增高，有显著的统计学差异（P ＜0.01）；48 h组与72 h组相比，无统计学差异（P ＞0.05）；中、高剂量组：24 h组与48 h组相比，无统计学差异（P ＞0.05），24 h组、48 h组与72 h组相比，有显著的统计学差异（P ＜0.01）。提示中高浓度人参皂苷Rg3 可以抑制HT-29 细胞MMP-9 mRNA 的表达，抑制作用随着剂量的增加及时间的延长而增强。

2.2 人参皂苷Rg3 对TIMP-1 mRNA 表达的影响

PCR 扩增产物经3%琼脂糖电泳可看到与目的片段大小一致的电泳条带。β-actin内参照扩增片段为207 bp，TIMP-1 扩增片段为419 bp（图2）。

图2 各剂量人参皂苷Rg3及对照培养HT-29细胞24 h后TIMP-1 mRNA表达

经不同浓度Rg3 处理后，不同时间点TIMP-1 mRNA表达见表2。

表2 不同时间组各浓度Rg3处理后TIMP-1 mRNA相对表达量（μg/mL，±s）

表2 不同时间组各浓度Rg3处理后TIMP-1 mRNA相对表达量（μg/mL，±s）

注：与0 μg/mL 组比较，aP＜0.01

0 25 50 100 3 3 3 3 24 h 0.141±0.003 0.148±0.002 0.180±0.002a 0.181±0.007a 48 h 0.138±0.002 0.155±0.001a 0.194±0.002a 0.210±0.005a 72 h 0.128±0.005 0.163±0.001a 0.212±0.005a 0.243±0.003a

实验结果显示，24 h 组：对照组与低剂量组相比，无统计学差异（P ＞0.05），与中、高剂量组相比，有显著的统计学差异（P ＜0.01）；48 h组和72 h组：对照组与低、中、高剂量组相比均有显著的统计学差异（P ＜0.01）。低剂量组：24 h组与48 h组相比，无统计学差异（P ＞0.05），24 h组与72 h组相比，有显著的统计学差异（P ＜0.01）；48 h组与72 h组相比，有明显的统计学差异（P＜0.05）；中、高剂量组：24 h组与48 h 组、72 h 组相比，有显著的统计学差异（P ＜0.01），48 h组与72 h组相比，有显著的统计学差异（P ＜0.01）。提示人参皂苷Rg3 可以促进HT-29细胞TIMP-1 mRNA的表达，促进作用随着剂量的增加及时间的延长而增强。

2.3 人参皂苷Rg3 对结肠癌细胞增殖的抑制率的影响 24 h组：低剂量组与中剂量组相比，无统计学差异（P ＞0.05），低、中剂量组与高剂量组相比，有显著的统计学差异（P ＜0.01）；48 h组，低剂量组与中、高剂量组相比，有显著的统计学差异（P ＜0.01），中剂量组与高剂量组相比，无统计学差异（P ＞0.05）；72 h 组：低剂量组与中、高剂量组相比均有显著的统计学差异（P ＜0.01），中剂量组与高剂量组相比，有显著的统计学差异（P ＜0.01）。说明人参皂苷Rg3对HT-29细胞生长的抑制作用与药物浓度的增加及作用时间延长而增强（见表3）。

表3 人参皂苷Rg3对HT-29细胞生长的抑制率(%，±s)

表3 人参皂苷Rg3对HT-29细胞生长的抑制率(%，±s)

注：与25 μg/mL组相比，aP＜0.01；与50 μg/mL组相比，bP＜0.01

不同剂量组（μg/mL）25 50 100 24h 21.17±1.85 23.30±3.20 31.83±4.89a、b 48h 29.27±2.45 35.73±2.83a 38.20±1.39a 72h 36.10±2.55 42.80±3.48a 48.33±1.65a、b

3 讨论

人参皂苷Rg3为近年从人参根的浸出液中分离出的一种有效成分，是一种微量四环三萜皂苷。大量研究显示具有抑制肿瘤细胞转移、抑制肿瘤新生血管形成、诱导肿瘤细胞凋亡[1]，抑制肿瘤细胞的浸润和转移和提高机体免疫功能的作用。 人参皂苷Rg3 还可以抑制肿瘤细胞的黏附、浸润、增殖，抗肿瘤新生血管的形成，提高机体免疫功能以及与化疗药联合应用的减毒增效作用，从而有显著的抗肿瘤作用。

MMPs是在降解细胞外基质过程中起作用的一类锌离子依赖性内肽酶，其中MMP-2、MMP-9又称明胶酶，主要降解IV型胶原，在动脉粥样硬化、心肌梗死及肿瘤侵袭和转移等以细胞外基质过度破坏为主要特征的病理过程中发挥着重要作用。降解细胞外基质（extracellular matrix,ECM）是肿瘤细胞侵袭、转移的重要步骤，在肿瘤侵袭转移中起关键性作用。激活的MMPs 的活性受特定TIMPs 的调节，其中TIMP-1是MMP-9的特异性抑制剂。本实验显示在同一作用时段随着人参皂苷Rg3浓度增加由0 μg/mL至100 μg/mL，各组MMP-9的表达降低；在同一人参皂苷Rg3 浓度作用下，总体上，随着时间延长，MMP-9 的表达也降低。25 μg/mL 组未显示出明显抑制作用，可能与此剂量不能抑制MMP-9的表达或样本不足有关。这与他人在其他肿瘤细胞株作用的研究相似，Xu 等[2]的研究显示人参皂苷Rg3 降低SKOV-3 细胞MMP-9 的表达，能减少穿越Matrigel的SKOV-3 细胞数。李博等[3]Rg3 可减少乳腺癌细胞(MCF-7)分泌MMP-9,表达量随Rg3 浓度增高而减少。本研究还显示促进TIMP-1 的表达，并且随着药物浓度的增加及时间的延长而增强。TIMP-1能与活化状态的MMP-9 以1∶1 的分子比例非共价键结合，形成不可逆的稳定复合物，从而阻断MMP-9与底物结合，抑制其酶活性。人参皂苷Rg3在本研究中下调MMP-9 的表达，促进TIMP-1 的表达，人为地调节MMP-9和TIMP-1之间的平衡，改变MMP-9/ TIMP-1 的比值，更利于发挥抗肿瘤的作用。因为总体上讲ECM 与MMPs/TIMP-1 比值的关系更为密切。对HT-29 细胞增殖有抑制作用，Zhang 等[4]低剂量环磷酰胺联合人参皂甙Rg3 抗Lewis 肺癌的血管生成而抑制肿瘤的浸润转移。认为MMP-9 是肿瘤浸润、转移的标志物，抑制其表达可抑制肿瘤的浸润转移。人参皂苷Rg3多途径抗肿瘤增殖及浸润、转移，但如何协同、在何阶段协同以及对肿瘤微环境的影响尚需进一步研究。

[1]高船舟, 曲淑贤, 吕广艳, 等. 20(R). 人参皂甙Rg3 对K562/ADM细胞凋亡诱导的研究[J]. 大连医科大学学报, 2001, 23(3)：171-173.

[2]Xu TM, Cui MH, Xin Y, et al. Inhibitory effect of ginsenoside Rg3 on ovarian cancer metastasis. Chin Med J, 2008, 121(15):1394-1397.

[3]李博, 杨威, 郑永晨. 人参皂苷Rg3对乳腺癌细胞表达MMP-2和MMP-9的影响[J]. 中国老年学杂志, 2005, 25(8):953-954.

[4]Zhang Q, Kang X, Zhao W. Antiangiogenic effect of low-dose cyclophosphamide combined with ginsenoside Rg3 on Lewis lung carcinoma. Biochen Biophys Res Commun, 2006, 342（3）: 824-828.