Notch1和Jagged1表达与肾透明细胞癌发病及预后

吴科荣，许 乐，张 立，侯 君，林宗明，蒋照辉

1.浙江省宁波市第一医院泌尿肾病中心（宁波315000）

2.复旦大学附属中山医院（上海200032）

我们曾经报道了Notch 通路中重要配体蛋白Jagged1的表达与肾癌的分级、分期、肿瘤大小有关，Jagged1 的表达水平可以作为早期肾癌的独立预后因子[1]。本研究综合利用免疫组化和Western blot的方法，选择2003年3月—2008年11月在复旦大学附属中山医院行肾癌手术，术后病理证实为肾透明细胞癌的病例共计129 例，以更大样本量进一步检测Notch1 与Jagged1 在肾癌组织及正常肾组织中的表达,并探讨蛋白表达与临床病理特征的关系，以及Notch1与Jagged1作为肾癌预后判断指标的价值。

1 对象与方法

1.1 一般资料 本组129例中，男84例，女45例；年龄27～83 岁，平均55.5 岁。采用肾根治术122 例(94.6%)，肾部分切除术7 例(5.4%)。肿瘤按TNM(2002 AJCC)分期：Ⅰ期81 例, Ⅱ期17 例，Ⅲ期24例, Ⅳ期7例。肿瘤按Fuhrman分级：1级53例，2级54 例，3 级18 例，4 级4 例。肿瘤大小1.5～15 cm，平均5.3 cm。平均随访时间47.2个月。37例术后出现复发(28.7%)，92例未发现肿瘤术后复发(71.3%)。86例无瘤生存，6 例带瘤生存。死亡37 例，其中31 例死于肿瘤，6例死于其他疾病。

1.2 研究对象 本项研究经由复旦大学伦理委员会批准（NO.2008-98）。129例均取术后肾癌组织切片标本，用于免疫组化染色，其中33例同时在距离癌组织边缘5.0 cm 以外的正常组织处取材作为对照。组织标本均采用10%甲醛固定，石蜡包埋，5 μm连续切片。其中8例在术中即刻采集新鲜肾癌标本及远离肿瘤的正常肾组织，用作Western blot检测。组织在经病理检查，迅速导入液氮肿瘤库保存。

1.3 Western blot 肾癌肿瘤组织及相应正常组织共8 例，每20 mg 组织加入0.25 mL RIPARIPA 缓冲液，加入蛋白酶抑制剂混合物，组织匀浆使细胞充分裂解，离心获取总蛋白。以Bradford法作蛋白定量，每个样本取100 μg蛋白，加入上样缓冲液，沸水浴中5 min，行7%SS-PAGE凝胶电泳130 V 2 h后转硝酸纤维素膜，90 V 90 min。转磨结束后取下硝酸纤维素膜，5%牛奶封闭1 h，TBST 清洗，加入一抗（分别为兔抗人Notch1 多克隆抗体ab27526 ，Abcam，UK；羊 抗 人Jagged1 多 克 隆 抗 体sc-6011，Santa Cruz，USA）4 ℃过夜，加入辣根过氧化物酶标记的对应二抗检测。

1.4 免疫组化染色 采用EV二步法染色。常规脱蜡、脱水后，3%新鲜双氧水避光孵育30 min灭活内源性过氧化物酶；热抗原修复(抗原修复液为pH 6.0枸橼酸盐缓冲液)。滴加一抗（分别为兔抗人Notch1多克隆抗体ab27526，Abcam，UK；羊抗人Jagged1 多克隆抗体sc-6011，Santa Cruz，USA），室温下孵育1 h，洗涤后再分别滴加辣根过氧化物酶标记的二抗。DAB 显色、苏木素复染、封片。用已知乳腺导管癌阳性切片做阳性对照，以PBS 代替一抗作为阴性对照。

1.5 染色结果判定 染色片均由3位独立的观察者进行染色评价，观察者对病例信息均无任何了解。染色强度和染色程度的评价依据为既往的文献[2]报道：先在低倍镜下随机选择3个视野（×40），计数100 个肿瘤细胞阳性百分比，定义细胞无染色为阴性，1%～20%细胞染色为1分，21%～60%细胞染色为2分，61%～100%细胞染色为3分。通过观察高倍镜（×200）下肿瘤细胞染色强度，定义不着色为0 分，浅棕黄色为1 分，棕黄色为2 分，深褐色为3 分。定义免疫染色评分为上述2 项指标之和，并定义0～3分为蛋白低表达，4～6分为蛋白高表达。

1.6 统计学分析 所有数据均选用SPSS 15.0软件行统计学分析。蛋白表达与临床病理参数的关系采用卡方检验，生存分析采用Kaplan-Meier 曲线和Cox Regression 模型。P ＜0.05 认为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 Western blot Jagged1蛋白在6例标本的肾癌组织中的表达水平（6/8，75.0%）高于在配对的正常组织中的表达，Notch1 蛋白在7 例标本的肾癌组织中的表达水平（7/8，87.5%）高于在配对的正常组织中的表达（图1）。总体上，Jagged1 蛋白及Notch1 蛋白在肾癌组织中的表达高于其周围正常肾组织中的表达。

2.2 免疫组化染色 Notch1、Jagged1在肾癌组织中免疫组化染色主要表现为肿瘤细胞胞膜染色和（或）胞浆染色，小部分肿瘤细胞胞核亦染色（图2、图3）。Notch1、Jagged1在正常肾组织中的阳性表达率分别为36.4%(12/ 33)、42.4%(14/ 33)，在肾癌组织中的阳性表达率分别为95.3%(123/129) 、93.0%(120/129)。Notch1 及Jagged1 在肾癌组织中的表达均高于其在正常肾组织中的表达(P＜0.05)。

图1 Western blot显示Notch1蛋白及Jagged1蛋白在肾癌组织及正常肾组织中的表达1T～8T分别代表8例肿瘤组织，1N～8N分别代表8例正常肾脏组织

图2 肾透明细胞癌组织Notch1免疫组化染色（×200）

图3 肾透明细胞癌组织Jagged1免疫组化染色（×200）

2.3 Notch1、Jagged1 表达与肾癌临床病理的相关性 随着肾癌病理分级和临床分期的增高，Notch1和Jagged1的表达水平都增高。Notch1和Jagged1的表达水平还与肿瘤大小有关：在直径≥5 cm的肿瘤中的表达要高于在直径＜5 cm 的肿瘤中的表达。两者的表达水平在不同年龄和不同性别的病例中无显著差异（表1）。

2.4 Notch1、Jagged1表达与预后的关系 肿瘤复发与Notch1、Jagged1表达水平有关。复发组Notch1 和Jagged1蛋白的表达水平均高于未复发组，差异均有统计学意义（P＜0.05）（表1）。

表1 Notch1、Jagged1 的表达与临床病理参数间的相关分析

通过Kaplan-Meier 曲线进行分析，总生存率（overall survival, OS）和无病生存率（disease free survival, DFS）均与Notch1、Jagged1 表达水平有关。低表达Notch1的病例组，其OS和DFS明显优于高表达Notch1 的病例组(P=0.028, 0.032)；低表达Jagged1的病例组OS和DFS明显优于高达Jagged1的病例组(P ＜0.001,＜0.001)（图4）。单因素分析显示，Notch1 与Jagged1 表达水平对肾透明细胞癌患者生存率影响有统计学意义。

通过Cox Regression模型，纳入包括年龄、性别、肿瘤大小、分期、分级及Notch1、Jagged1表达水平等因素进行分析，发现Jagged1表达水平可以作为影响肾透明细胞癌预后的独立预后因子(P=0.035,0.028) (表2、表3)。而Notch1 作为独立预后因子证据尚不充分(P=0.917，0.859)(表2、表3)。

3 讨论

图4 A、B：低表达Notch1的病例组，其总生存率（OS）和无病生存率（DFS）明显优于高表达Notch1的病例组(P=0.028, 0.032)；C、D：低表达Jagged1的病例组其总生存率（OS）和无病生存率（DFS）明显优于高达Jagged1的病例组(P<0.001, <0.001)

表2 多因素Cox风险模型分析总生存率结果

表3 多因素Cox风险模型分析无病生存率结果

肾透明细胞癌是泌尿系统最重要的恶性肿瘤之一，其发生发展与Von Hippel—Lindau（VHL）抑癌基因失活有关。针对血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor, VEGF)受体的分子靶向治疗，目前已经成为转移性肾癌的一线治疗方法，但仍存在有效率低、不良反应明显等缺点[3]。随着对肾癌分子基因基础的进一步了解，更多的信号通路揭示与肾透明细胞癌发病有关，对这些通路的研究，不仅可以进一步完善肾癌发病机制，而且可能提供其他的治疗靶向[3]。

Notch通路是进化上十分保守的通路，其受体有Notch1、Notch2、Notch3、Notch4，配体包括Jagged1、Jagged2、Dll1、Dll3、Dll4。当受体与配体结合后，受体的胞内段NOTCHIC释放，进入细胞核并启动下游靶基因如Hes基因等的表达。

Notch 通路广泛表达于从无脊椎动物到哺乳动物等多个物种，在细胞的分化、增殖、凋亡、迁徙、粘附等生命活动中都起到重要作用。异常的Notch信号已经证明与许多肿瘤的发生有关。目前Notch与肾透明细胞癌的关系尚不十分明确，研究少且意见不一。Sun 等[4]的研究结果认为，Notch 在肾透明细胞癌中低表达，而Rae[5]、Zhao 等[6]则发现，肾透明细胞癌中Notch3、Jagged1 高表达。Sjölund 等[7]在肾透明细胞癌细胞株中测得Notch通路各组成蛋白高表达，这种表达与经典通路中VHL、HIF-1a、HIF-2a的表达是相对独立的。

在本项研究中，我们通过Western blot和较大样本的免疫组化结果发现，Notch1与Jagged1在肾透明细胞癌组织中存在表达，其阳性表达率高于在正常肾组织中的表达，并且发现Notch1和Jagged1的表达水平与肿瘤的病理分级、临床分期和肿瘤大小均有关。这些结果有力提示，Notch通路在肾透明细胞癌的发生发展中起到致癌的作用。

Notch通路的致癌作用可能与其在维持干细胞功能、抑制细胞分化、抑制细胞凋亡中的功能有关[8]。另外，可能还与其在肿瘤血管生成中的作用有关。Patel 等[9]测定Notch 通路的配体之一DLL-4 在透明细胞癌中的表达，是在正常肾组织表达程度的9倍，并且这种表达与VEGF的表达正相关。Zeng等[10]报道了高表达Jagged1 头颈鳞状细胞癌(head and neck squamous cell carcinoma, HNSCC)细胞更容易形成丰富的肿瘤血管和更大的瘤体。而Sjölund等[7]采用γ分泌酶抑制剂抑制肾癌Notch 通路后发现，细胞周期蛋白依赖性激酶抑制剂（cyclin-dependent kinase inhibitors, CDKi）p21 和p27 水平的上调，揭示Notch致癌的机制还可能与抑制p21和p27有关。

在肾癌预后判断方面，国内外学者在解剖水平、临床水平、组织学水平和分子水平上发现了众多影响因素。其中既有独立的预后因素,也有协同作用的多个因素。在分子水平，研究较多的预后因子有HIF-1α、CAIX、VEGF 等。在本项研究中，我们探讨了Notch1 和Jagged1 对肾癌预后的影响。单变量分析揭示Notch1 与Jagged1 表达水平对肾透明细胞癌患者生存率影响均有统计学意义，高表达Notch1或Jagged1预示肾癌不良预后。而在多变量分析中，Jagged1 的表达水平可以作为判断肾透明细胞癌预后的独立预后因子，显示出其在临床上肾癌预后判断中的意义和价值。国外有人报道，Notch通路在乳腺癌的发生发展中起着促癌的作用，并且Jagged1高表达提示乳腺癌患者的不良预后[11]。而在转移性前列腺癌中，Jagged1高表达的前列腺癌病例的肿瘤复发概率比Jagged1 低表达的前列腺癌病例高[12]。结合我们的结果，我们推测，Notch 通路的活化经由Jagged1介导并与恶性肿瘤形成及疾病进展有关。

与Jagged1不同，Notch1作为独立预后因子依据尚不足。这其中的原因有：⑴Notch通路有多个受体和配体，而Notch1与Jagged1并非严格的一一配对关系。⑵Notch 与其他通路之间存在的交集对该通路的调控和影响。⑶病例数量不足，因此需要更加大样本的研究进一步证实Notch1 在肾癌预后判断方面的作用和价值。

本研究通过使用Western blot 及免疫组化的方法，证实了Notch 通路重要组成蛋白Notch1 和Jagged1在肾透明细胞癌中高表达，并与肾透明细胞癌发生发展有关。单因素和多因素生存分析显示两者（尤其是Jagged1）对肾癌预后的影响，为指导临床上肾癌预后判断提供了新的指标。Notch 通路作为肿瘤治疗靶点待进一步探索，具有广阔的研究前景和价值。

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