结核分枝杆菌Ag85A DNA疫苗抗结核作用的研究

梁艳 吴雪琼 张俊仙 白雪娟 阳幼荣 李宁 余琦 李忠明 王兰 史迎昌

结核病是一种慢性呼吸道传染病，合理、规律的化疗一般在1～2个月内即可杀死病灶内绝大多数Mtb，但仍有少量菌残留，尤其是寄生于巨噬细胞内的Mtb不易被杀死，需继续治疗3～4个月，甚至更长时间。由于耐多药结核病的流行、化疗药物的不良反应，以及人免疫缺陷病毒（human immunodeficiency virus，HIV）的感染、免疫抑制剂的使用和老年性结核病等原因引起的机体免疫功能低下，使难治性结核病增多，抗结核治疗面临巨大的挑战，尤其是耐多药结核病（MDR－TB）、广泛耐药结核病（XDR－TB）面临无药可治的困难局面。因此，研制新的抗结核制剂及新的有效、价廉的治疗方案势在必行。

抗结核免疫主要是细胞介导的免疫反应，体液免疫是否起作用尚有争议，机体的免疫状态与结核病的发生、发展和转归密切相关。治疗性疫苗的应用对象与预防性疫苗不同，前者用于Mtb感染者或结核病患者，而后者用于正常人群。免疫治疗可以通过调节或选择性地诱导结核病患者免疫系统蕴藏的潜力，来达到治疗疾病的目的。在抗结核化疗的基础上联合免疫治疗有可能缩短疗程，实现“超短程化疗”。近年来通过免疫调节辅助治疗结核病成为研究的热点之一，免疫治疗制剂的研究与开发成为一个十分重要的研究方向。死疫苗（如微卡菌苗和乌体林斯）只能诱导体液免疫和Th1型细胞免疫应答，不能诱导特异性细胞毒性T淋巴细胞（cytotoxic T lymphocyte，CTL）应答；而DNA疫苗在细胞内生成内生性抗原，不仅能诱导体液免疫和Th1型细胞免疫应答，还能诱导特异性CTL应答，这对于杀灭巨噬细胞内寄生的分枝杆菌更有意义。因此，解放军第三〇九医院全军结核病研究所和上海海规生物科技有限公司联合研制了Mtb Ag85A DNA疫苗，并在国内外首先将其用于结核病治疗研究［1］。笔者简要地概述本课题组 Mtb Ag85A DNA疫苗抗结核作用的研究情况。

一、免疫原性的研究

1.小鼠血清中抗Ag85A蛋白抗体水平：小鼠免疫前、第1次至第3次免疫后10 d取血清，通过ELISA方法检测各组抗Ag85A抗体，以各组小鼠免疫前抗体水平为对照，计算生理盐水组、p VAX1载体组、微卡菌苗组和Ag85A DNA疫苗组小鼠第1次至第3次免疫后抗体升高水平。

生理盐水组在第1次至第3次免疫后，抗Ag85A抗体水平均无显著增高（P＞0.05）。p VAX1载体组在第1次至第3次免疫后，抗Ag85A抗体均极显著增高（P＜0.01），于第2次免疫后达到高峰，证明p VAX1载体具有一定的非特异免疫增强作用。微卡菌苗组在第1次免疫后，抗Ag85A抗体极显著增高（P＜0.01）；第2次、第3次免疫后，抗Ag85A抗体也显著增高（P＜0.05）；于第3次免疫后达到高峰，表明微卡菌苗具有非特异免疫增强作用。Ag85A DNA疫苗组在第1次至第3次免疫后，抗Ag85A抗体均极显著增高（P＜0.01），于第2次免疫后达到高峰，抗体升高水平均显著高于对照组，证明Ag85A DNA疫苗可刺激小鼠特异的体液免疫功能。

2.小鼠第3次免疫后分泌γ干扰素的T淋巴细胞斑点数［2］：小鼠第3次免疫后14 d杀鼠取血抗凝，通过酶联免疫斑点实验（enzyme－linked immunospot assay，ELISPOT）方法检测各组分泌γ干扰素的T淋巴细胞斑点数，以各组小鼠空白对照孔为对照，计算各组小鼠检测孔的细胞斑点数。

生理盐水组未见Ag85A特异的分泌γ干扰素的T淋巴细胞；p VAX1载体组和微卡菌苗组均可见少量Ag85A特异的分泌γ干扰素的T淋巴细胞；而Ag85A DNA疫苗组可见大量Ag85A特异的分泌γ干扰素的T淋巴细胞。结果表明Ag85A DNA疫苗显著增强了小鼠特异的细胞免疫功能。

3.小鼠脾淋巴细胞分泌γ干扰素和白细胞介素－4的水平［2］：小鼠第3次免疫后14 d杀死小鼠，取脾脏，研磨后分离脾淋巴细胞，经抗原刺激后，通过ELISA方法检测各组分泌的γ干扰素和白细胞介素－4，计算各组小鼠检测孔的细胞因子分泌量。

Ag85A DNA疫苗组小鼠脾淋巴细胞分泌γ干扰素的水平明显高于生理盐水组、p VAX1载体组和微卡菌苗组，而分泌白介素－4的水平明显减少。结果表明Ag85A DNA疫苗主要刺激Th1型的免疫反应。

4.Mtb MPT64、ESAT6、Ag85A和 Ag85B 4种 DNA疫苗免疫原性的比较：（1）雌性BALB/c小鼠结核感染8周、第1次至第4次免疫治疗后2周及免疫治疗5个月时，通过ELISA方法检测各组抗结核分枝杆菌分泌蛋白64（Mycobacterium tuberculosis secreted protein 64，MPT64）或早期分泌抗原靶6 （early secretory antigenic target 6，ESAT6）或Ag85A抗体。通过动态观察DNA疫苗组小鼠抗特异性抗原抗体的变化，发现一般在第2次免疫治疗后，抗体才开始升高，第3、4次达到高峰，停止治疗3个月后抗体已开始下降或明显下降，说明 MPT64、ESAT6、Ag85A DNA疫苗肌内注射后确实能在机体内表达蛋白，但DNA疫苗激活B细胞的反应较滞后，可能是因为抗体的产生有赖于完整抗原被B细胞识别。其中MPT64 DNA疫苗诱导的抗体水平最高，其次是ESAT6 DNA疫苗，Ag85A DNA疫苗诱导的抗体水平较低，可能是因为ESAT6和Ag85A是T细胞抗原，主要刺激T淋巴细胞，而MPT64既是T细胞又是B细胞抗原；也可能是MPT64在体内表达量较高，而其他2种质粒DNA表达量较低所致。上述3种抗体均以IgG2a和IgG1为主，IgG2a均显著高于IgG1，说明主要诱导Th1型免疫功能。这3种质粒DNA都能较好地刺激机体的细胞免疫功能，使脾淋巴细胞转化率显著增高［3］。（2）通过ELISA方法检测雌性C57BL/6小鼠第3次DNA免疫后第12 d血清中抗MPT64、ESAT6、Ag85A 和 Ag85B抗 体IgG 及 其 亚 型IgG1、IgG2a和IgG2b。结果显示 MPT64、ESAT6、Ag85A和Ag85B DNA免疫后均可诱导产生特异性抗体。但MPT64或ESAT6与IL－12或γ干扰素质粒DNA共同免疫小鼠后，抗MPT64或ESAT6抗体水平无显著升高，与对照组相比较差异无统计学意义，说明DNA疫苗与细胞因子共同免疫后，细胞因子可减少小鼠对DNA疫苗的抗原特异性抗体反应，主要诱导细胞免疫功能［4］。此外，上述4种抗体亚型IgG2a均无显著升高，IgG2b均显著高于IgG1，表明C57BL/6小鼠主要是IgG2b升高为主，与BALB/C小鼠主要以IgG2a升高为主不同。但无论是IgG2a还是IgG2b占优势都说明是诱导Th1型免疫功能为主，而结核的保护性免疫恰恰与一个强的Th1型T细胞反应的建立有关。

鉴于Ag85A DNA疫苗以诱导Th1型免疫反应为主；免疫治疗2个月时，肺菌落数减少较其他DNA疫苗显著，因此，选择Ag85A DNA疫苗治疗小鼠结核病模型1～2个月进一步研究。

二、Mtb Ag85A DNA疫苗治疗抗结核药物敏感的结核病的疗效

用Mtb H37Rv通过尾静脉注射50只BALB/c小鼠，分别用生理盐水、p VAX1载体、利福平（RFP）、草分枝杆菌菌苗和Ag85A DNA疫苗治疗。免疫治疗3次后，与生理盐水对照组比较，p VAX1载体组肺菌落数显著高于生理盐水组（P＜0.05），肝脏菌落数差异无统计学意义（P＞0.05）；RFP治疗组、草分枝杆菌菌苗治疗组和Ag85A DNA疫苗治疗组的肺和肝脏菌落数均显著减少（P＜0.01）；RFP组肺和肝脏菌落数均比草分枝杆菌菌苗组和Ag85A DNA疫苗组显著减少（P＜0.001）；草分枝杆菌菌苗组和 Ag85A DNA疫苗组的肺和肝脏菌落数差异无统计学意义。

免疫治疗5次后，与生理盐水对照组比较，p VAX1载体组肺和肝脏菌落数差异无统计学意义（P＞0.05）；RFP治疗组、草分枝杆菌菌苗治疗组和Ag85A DNA疫苗治疗组的肺和肝脏菌落数均非常显著地减少（P＜0.001或P＜0.01）；RFP组肺和肝脏菌落数均比草分枝杆菌菌苗组和Ag85A DNA疫苗组显著减少（P＜0.001）；草分枝杆菌菌苗组和Ag85A DNA疫苗组的肺和肝脏菌落数差异无统计学意义。

从小鼠肺、肝菌落计数来看，与对照组相比，各治疗组均有一定的治疗作用，免疫5次和免疫3次，Ag85A DNA疫苗的治疗效果相似，但免疫5次的效果较3次时明显；Ag85A DNA疫苗的免疫治疗效果与草分枝杆菌菌苗相当。

三、Mtb Ag85A DNA疫苗联合化学药物治疗耐多药结核病的疗效研究

DNA疫苗每隔2周免疫1次，共免疫5次。

1.第一次研究：（1）肺组织病理学检查［5］：肺组织用10%的多聚甲醛固定后包埋在石蜡中切片。组织切片用苏木精和曙红试剂染色，在光学显微镜下观察分析结果。生理盐水组、p VAX1载体治疗组肺组织病变广泛，未见或少见增殖性结节；RFP治疗组、RFP加Ag85A DNA疫苗治疗组、Ag85A DNA疫苗治疗组、RFP加 Ag85A/ESAT6嵌合DNA疫苗治疗组、Ag85A/ESAT6嵌合DNA疫苗治疗组、微卡菌苗治疗组肺组织病变均较轻，病变范围局限，可见较多的结核结节，主要呈增殖性改变。（2）肺、脾悬液涂片抗酸染色［6］：各对照组和RFP对照组肺Mtb较粗大，而各疫苗治疗组肺部分 Mtb变细而短。（3）肺和脾菌落计数［5］：各疫苗治疗组肺脾菌落计数均比对照组和RFP治疗组减少2～5倍。与生理盐水对照组比较，p VAX1载体组和RFP治疗组的肺和脾脏菌落数差异无统计学意义（P＞0.05）；微卡菌苗治疗组、HSP65 DNA疫苗、Ag85A DNA疫苗和Ag85A/ESAT6嵌合DNA疫苗治疗组的肺和肝脏菌落数均显著减少（P＜0.05或P＜0.001）；Ag85A DNA疫苗单独治疗或联合RFP治疗小鼠耐多药结核病模型的肺和脾脏菌落数均少于Ag85A/ESAT6嵌合DNA疫苗治疗组和HSP65 DNA疫苗治疗组，但差异无统计学意义（P值均＞0.05）。

2.第二次研究［2］：（1）各组小鼠死亡情况：p VAXI载体组、RFP治疗组、微卡菌苗治疗组、Ag85A/ESAT6嵌合DNA疫苗治疗组、RFP加Ag85A/ESAT6嵌合DNA疫苗治疗组小鼠死亡率分别是10%、10%、10%、100%、20%，吡嗪酰胺（PZA）治疗组、Ag85A DNA疫苗治疗组、RFP加Ag85A DNA疫苗治疗组、PZA加Ag85A DNA疫苗治疗组和PZA加Ag85A/ESAT6嵌合DNA疫苗治疗组小鼠均存活。（2）肺脏组织病理改变：治疗结束后4周，p VAX1载体组和RFP组肺组织病变严重、广泛，实变，肺泡壁重度肿胀、增厚，正常肺泡结构消失，可见大量的淋巴细胞浸润。PZA组小鼠肺组织病变比p VAX1载体组和RFP组略轻，肺泡壁中度和重度增厚，1/5区域可见正常的肺泡结构，病变区域可见多核巨细胞、泡沫样细胞和中等量淋巴细胞。Ag85A DNA疫苗组、Ag85A DNA疫苗联合RFP组、Ag85A DNA疫苗联合PZA组小鼠肺组织病变比PZA组轻，病灶局限，1/2区域可见正常的肺泡结构，肺泡轮廓相对清晰，病变区域可见多核巨细胞、泡沫样细胞和少量淋巴细胞。Ag85A/ESAT6嵌合DNA联合RFP组、Ag85A/ESAT6嵌合DNA联合PZA组小鼠肺组织病变比PZA组轻，病灶局限，但治疗效果不如Ag85A DNA疫苗单独治疗组或联合药物治疗组。（3）肺、脾活菌计数：与对照组相比，Ag85A DNA疫苗单独治疗或与RFP、PZA联合治疗的肺和脾菌落数分别减少了1.0～1.38 logs。上述2次研究结果显示，应用HSP65、Ag85A和Ag85A/ESAT6嵌合DNA疫苗治疗耐多药结核病的小鼠，并以微卡菌苗、RFP、PZA、质粒载体和生理盐水为对照，免疫治疗2个月后，RFP单独治疗耐多药结核病无效，而PZA治疗有效，说明成功地建立了小鼠耐多药结核病模型；与对照组相比，各疫苗治疗组均有明显的疗效，尤其是Ag85A DNA疫苗单独应用或联合化疗的疗效明显强于Ag85A/ESAT6嵌合DNA疫苗、HSP65 DNA疫苗和微卡菌苗组，与抑菌药PZA相当。其机制可能是抗结核药物虽不能杀灭耐多药 Mtb，但对该菌具有一定的抑制作用；Ag85A DNA疫苗能调动机体的免疫功能杀灭已被抑制的Mtb，并增强RFP或PZA对耐多药Mtb的杀菌效力。ESAT 6与Ag85A嵌合构建的DNA疫苗未能增强Ag85A DNA疫苗的治疗效果，可能是由于ESAT6是Mtb毒力因子所致，由此可见抗原的选择至关重要。

总之，结核病是一种细菌性传染性疾病，从另一个角度来看也是一种细胞免疫疾病，Mtb Ag85A DNA疫苗可诱导小鼠体液免疫和Th1型细胞免疫应答，可减少小鼠组织中的Mtb尤其是耐多药Mtb的数目，该疫苗与常规化疗联合不仅可提高机体免疫力，并可有效地杀灭或抑制Mtb，提高化疗效果，缩短疗程，从而为结核病尤其是耐药结核病的治疗开辟了新途径。

［1］吴雪琼，张俊仙，李洪敏，等.结核分枝杆菌Ag85A DNA疫苗免疫治疗作用的研究.中国免疫学杂志，2002，18（1）：17－22.

［2］Liang Y，Wu X，Zhang J，et al.Treatment of multi－drug－resistant tuberculosis in mice with DNA vaccines alone or in combination with chemotherapeutic drugs.Scand J Immunol，2011，74（1）：42－46.

［3］吴雪琼，李洪敏，史迎昌，等.结核分枝杆菌DNA疫苗抗结核作用的研究.中国生物制品学杂志，2002，15（6）：340－345.

［4］吴雪琼，郑越，徐燕杰，等.不同剂量结核病DNA疫苗及细胞因子联合免疫的研究.中国免疫学杂志，2006，22（10）：883－894.

［5］Liang Y，Wu X，Zhang J，et al.The treatment of mice infected with multi－drug－resistant Mycobacterium tuberculosis using DNA vaccines or in combination with rifampin.Vaccine，2008，26（35）：4536－4540.

［6］白雪娟，李宁，余琦，等.DNA疫苗对感染结核分枝杆菌耐药株小鼠治疗效果的病理学评价.中华临床医师杂志（电子版），2010，5（1）：74－79.