新型结核病疫苗的研究现状与发展趋势

吴雪琼

目前结核病依然是全球感染性疾病的第一“杀手”，Mtb耐药问题越来越严重，艾滋病、移民和贫困等社会问题使得结核病在一些发达国家开始回升。我国的结核病疫情和耐药情况都较严重，2011年全国第五次结核病流行病学抽样调查结果显示，我国结核病年发病人数约为130万，占全球发病的14.3%，位居全球第2位。结核病疫情未能获得控制，究其根本原因是缺乏有效的疫苗预防结核病的发生。新型结核病疫苗的研究已成为国内外结核病研究的热点之一，比尔·盖茨专门成立全球结核病疫苗基金会（Aeras Global TB Vaccine Foudation，简称AERAS）；我国重大传染病专项均支持结核疫苗的研究。根据疫苗的用途可将其分为两类：一是预防性疫苗，主要应用于新生儿和未感染的正常人群，保护其不被Mtb感染；二是治疗性疫苗，主要应用于己感染Mtb的无症状携带者，使其不发病，或用于己发病的患者，促进其早日痊愈。

一、卡介苗的预防效果

卡介苗（BCG）是牛结核分枝杆菌的减毒活疫苗，自1928年BCG用于人类以来，已在世界各地广泛应用，已证明其是世界上最安全的疫苗之一，其免疫原性约持续10年，可有效地预防严重的结核病（如播散型结核、结核性脑膜炎），保护效力为65%～95%（平均86%），但不能预防Mtb的感染，对肺结核的保护效力是0%～80%，差异很大。究其原因可能受下列因素的影响：（1）BCG菌株差异：在冻干技术发明前，通过培养传代和保存使当年预防肺结核非常有效的BCG菌株已不复存在。目前世界各国使用的BCG菌株之间差异极大，BCG缺失了129个基因阅读框架，缺失了一些毒力因子（如ESAT 6），也丢失了一些免疫保护基因，如一些能够诱导有意义的T细胞应答的休眠期抗原的缺失。（2）环境分枝杆菌的感染：虽产生一定程度的免疫保护效力，但也减弱了BCG的免疫保护作用。（3）Mtb感染菌株差异：不同地区人群感染的Mtb菌株在毒力、基因、蛋白表达等方面的差异，也会影响对BCG的免疫反应。（4）Mtb内源性复燃或外源性再感染：BCG不能预防Mtb内源性的复燃和外源性的再感染。（5）接种人群的差异：人群的遗传背景不同导致对BCG免疫反应的差异。（6）临床试验方法的差异：不同国家和地区进行的临床试验在实施方法、评价指标等方面也不完全一致，影响效果的评价。此外，对于免疫功能缺陷者，BCG接种可能导致全身播散。江西省胸科医院开展BCG免疫治疗的研究，目前尚有争议。因此，BCG不能预防肺结核的发生，研制新型更有效的疫苗替代BCG或加强BCG的效力势在必行。

二、新型结核病疫苗的研究策略

理想的结核病疫苗需具备下列条件：具有强的保护效力，只需免疫1次或少数几次即可预防Mtb感染和结核病发生；免疫原性稳定、持久；不良反应少；价廉；与其他疫苗相互间无干扰。分子生物学和免疫学的进步促进了结核新疫苗的发展，目前主要有以下几种研究策略：（1）取代BCG的初种疫苗（priming vaccine）：是一种优于BCG、具有更长久免疫保护效果的新疫苗，目前只有新型的重组分枝杆菌菌苗才有可能取代BCG。（2）增强BCG效果的加强疫苗（late booster vaccine）：目前主要研究亚单位疫苗（如重组蛋白疫苗、DNA疫苗）、以病毒为载体的疫苗，以增强、延长BCG初免的保护效果。（3）用于结核感染者的多相疫苗（postexposure multiphase vaccine）：既是一种预防性疫苗，又是一种治疗性疫苗，主要用于预防内源性复燃和外源性再感染。因此，该疫苗的设计需包含Mtb在急性感染期和潜伏期表达的两类免疫显性抗原。（4）用于结核病患者的治疗性疫苗（therapeutic vaccine）：目前主要研究亚单位疫苗与化疗联合应用，以促进痰菌阴转、病灶减少、空洞闭合，期望能够达到缩短疗程的目的。

三、新型结核病疫苗的研究

目前，结核病疫苗研究的种类主要有下列3种：活疫苗、亚单位疫苗和灭活疫苗。活疫苗包括基因重组活疫苗和减毒活疫苗，对Mtb或BCG进行改良以减少前者的致病力或提高后者的免疫保护效力。主要包括表达分枝杆菌T细胞抗原的重组活疫苗、表达细胞因子的重组BCG、Mtb营养缺陷型突变株、Mtb减毒活疫苗或其他的弱毒或无毒分枝杆菌活菌苗（如母牛分枝杆菌、耻垢分枝杆菌、微小分枝杆菌），其研制的关键在于免疫原性和安全性，希望获得替代BCG的初种疫苗。亚单位疫苗只用Mtb的一部分成分引起机体产生免疫保护反应，主要包括DNA疫苗、重组蛋白疫苗或多肽疫苗（加佐剂）、多肽以外的其他纯化的主要成分（如枝菌酸、糖脂，等等），它可作为BCG的加强疫苗或治疗性疫苗。灭活疫苗（如母牛分枝杆菌、草分枝杆菌菌苗）只能引起短暂的免疫反应，不能像活的Mtb那样刺激机体产生具有免疫保护性的细胞免疫反应，而不能产生持久、有效的免疫保护力，主要作为治疗性疫苗。

1.重组活疫苗：表达分枝杆菌抗原的重组活疫苗是利用基因工程技术将外源基因导入分枝杆菌（如BCG、耻垢分枝杆菌、母牛分枝杆菌等）或其他活细菌［如李斯特菌（Listeria monocytogenes）、沙门菌］、活病毒（如牛痘苗病毒、腺病毒或仙台病毒等）中，依靠细菌、病毒在宿主内的复制，表达外源抗原，以诱导机体产生特异性的体液和细胞免疫；表达细胞因子如［IFN－γ、IL－2、粒细胞－巨噬细胞集落刺激因子（GM－CSF）、IL－18］的重组BCG的免疫原性增强。这些基因工程菌苗不仅同时具备佐剂和载体功能，又具有多种外源抗原与活疫苗的作用，一次接种可获得强而持久的特异性免疫。

BCG是目前所知最强的免疫佐剂之一，具有持久的非特异免疫刺激作用，而且安全、成本低、稳定，以BCG作为工程菌的疫苗具有许多优点。德国柏林 Max－Planck研究所研制的rBCG：：ΔureC－hly疫苗VPM－1002，是表达李斯特菌的膜打孔李斯特菌素（Hly）而自身尿素酶C缺乏的重组BCG，Hly可促进抗原进入感染靶细胞的细胞浆，加强抗原特异性CD4＋和CD8＋T细胞的产生。在小鼠模型中抗Mtb的保护效力比BCG强，并可诱导很强的抗Mtb“北京”株的作用。在重症联合免疫缺陷（SCID）的小鼠中显示毒力较BCG弱，具有很好的安全性，2011年在南非进行Ⅱ期临床试验［1］。目前通过删除sec A2和nuoG构建了r BCG：：ΔureC－hly＋＋Δsec A2和rBCG：：ΔureC－hly＋ΔnuoG，增强了CD8＋和Th17 T细胞应答，提高了保护效力；通过删除pdx H 构建了rBCG：：ΔureC－hly＋Δpdx H 营养缺陷株，进一步改进了安全性。美国加利福尼亚大学洛杉矶分校医学院研制的r BCG30疫苗，是一种过量表达Mtb Ag85B抗原的重组BCG，可诱导强的免疫反应，产生的保护效率也比BCG强，已完成Ⅰ期临床实验［2］。武汉生物制品研究所目前正在引进AERAS－422，是一种过量表达 Mtb Ag85A、Ag85B和Rv3407的重组BCG，该疫苗目前在美国已完成Ⅰ期临床试验［3］。复旦大学、四川大学、华中科技大学同济医学院和解放军第三〇九医院研究的多种类型的重组BCG，第四军医大学研究的过表达Ag85B和ESAT6重组耻垢分枝杆菌菌苗尚处于临床前研究阶段。

英国牛津大学研制的 MVA－85A（AERAS－485）疫苗，是一种过表达 Mtb Ag85A的重组牛痘安卡拉病毒疫苗，动物模型及Ⅰ期临床试验均显示具有很好的免疫原性和保护性，用于人是安全的，目前正在冈比亚和南非进行Ⅱ期临床试验［4］。AERAS和欧洲Crucell NV生物技术公司联合研制的 Ad35－85B－TB10.4（AERAS－402），是一种过表达Mtb Ag85A、Ag85B和TB10.4融合蛋白的重组腺病毒35疫苗，目前在肯尼亚、莫桑比克、南非和乌干达进行Ⅱ期临床试验［5］。上述两种病毒载体疫苗主要作为加强BCG的疫苗。

Miki等［6］构 建 的2株 分 别 含 Ag85A 和Ag85B、MPB/MPT51的重组减毒李斯特菌，通过腹腔注射免疫C57BL/6小鼠，均能诱导PPD特异的足垫肿胀反应、脾淋巴细胞增殖反应和产生IFN－γ；通过静脉注射免疫BALB/c小鼠，也都能够诱导比BCG强的免疫保护反应。Hess等［7］报道结核Ag85B重组沙门菌疫苗可有效地诱导特异的IFN－γ和肿瘤坏死因子，也可保护小鼠抗Mtb的攻击。

2.Mtb减毒活疫苗或其他的弱毒或无毒分枝杆菌活菌苗：通过随机致突变或靶向同源重组技术从Mtb基因组中将某些与氨基酸的生物合成有关的基因、毒力基因或与Mtb在巨噬细胞内长期存活有关的基因敲除或致突变，制备Mtb减毒活疫苗。营养缺陷型减毒活疫苗在宿主体内只能存活较短的时间，通过有限的复制来刺激机体的保护性免疫反应。已发现许多Mtb氨基酸（甲硫氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、赖氨酸、脯氨酸、色氨酸、颉氨酸和泛酸盐等）营养缺陷株可保护小鼠抵抗Mtb的攻击，保护效力与BCG相当，如嘌呤营养缺陷型突变株不能在鼠巨噬细胞中生长，在小鼠和豚鼠动物模型中的毒力也减弱［8］；Mtb Erdman亮氨酸营养缺陷株在鼠巨噬细胞中也不能生长，在SCID小鼠中毒力也减弱，它减少肺、脾组织中细菌数的效力不如BCG，但组织病理损害减轻［9］。Collins等［10］通过等位基因交换除去牛结核分枝杆菌esat－6基因，获得2株牛结核分枝杆菌突变株 WAg520.4和 WAg530.1。WAg 520.4株保护肺的菌落计数与BCG相似，而抵抗细菌感染播散至脾的菌落计数比BCG少；WAg 530.1对脾的保护力与BCG无明显差异，对肺的保护力比BCG差。最近发现，许多牛结核分枝杆菌弱毒株在豚鼠可诱导一定程度的抗结核保护，但缺乏pckA基因的菌株保护效力降低。在小鼠动物模型上已证明母牛分枝杆菌和耻垢分枝杆菌菌苗对Mtb的攻击无保护作用，微小分枝杆菌菌苗多次注射后有一定的保护效力。

由此可见，减毒活疫苗的毒力和致病性显著降低，其免疫保护效力与BCG相似或优于BCG，但持续时间短，产生的记忆免疫效果也不佳，长期的稳定性尚不清楚，存在毒力回复的问题。目前在减毒活疫苗的研究方面除了考虑减毒外，尚无明确的标准用于确定应该加哪些基因、应该去除哪些基因，无法判断何种程度的减毒才是安全有效的。此外，即使获得了Mtb减毒株，将来可能会发生返祖而造成疫苗安全性的问题。国内较少研究。

3.DNA疫苗：由能引起机体保护性免疫反应的病原体抗原的编码基因和真核表达载体构建而成，它被注入机体后，通过宿主细胞的转录系统表达蛋白抗原，诱导宿主产生细胞免疫应答和体液免疫应答，从而达到预防和治疗疾病的目的。由于RNA疫苗不稳定，在体内存在时间短，表达短暂，生产、贮存、运输比DNA疫苗要求高。因此，目前研究最多的是DNA疫苗，它不需要任何化学载体，故又称为裸DNA疫苗 （naked DNA vaccine）。DNA疫苗可诱导体液免疫和Th1型细胞免疫应答，尤其是特异性细胞毒性T淋巴细胞（CTL）识别、杀伤、破坏被感染的细胞及清除细胞内的病原体，这对于清除寄生于巨噬细胞内的Mtb非常有意义。

目前，从Mtb分泌性蛋白和热休克蛋白中已发现了多种保护性抗原的基因疫苗，如Ag85A、Ag85B、ESAT－6、MPT64、Pst S－3、Mtb8.4、hsp65、hsp70、PPE 家 族 （如 Rv3873、Rv1196、Rv0916c）等［11］，在动物模型上它们可诱导细胞免疫应答，保护效力与BCG相当。DNA疫苗必须针对Mtb在增殖期和休眠期产生的抗原。不同的DNA疫苗具有不同程度的保护效力，某些DNA疫苗虽能刺激免疫应答，但却无保护效力或保护效力不如BCG，如Ag85C质粒DNA免疫小鼠均未产生保护作用；Pst S－2 DNA免疫鼠只有脾菌落计数中等减少；Pst S－1 DNA免疫小鼠完全不能抑制细菌增殖；麻风分枝杆菌和Mtb hsp60 DNA疫苗免疫小鼠后，虽然能诱导高水平的IL－2和IFN－γ，但Mtb气雾攻击，未见保护；富含脯氨酸的、相对分子质量为36 000（36 k Da）的DNA疫苗对小鼠的保护效力不如BCG组；MPB70、MPB83 DNA疫苗或 MPB70 DNA疫苗/MPB70蛋白加强免疫牛都不能保护牛抵抗牛结核分枝杆菌强毒株对气管内的攻击；相对分子质量为19 000、ahpC与BCG的相对分子质量为22 000的培养滤液蛋白、hsp10质粒DNA免疫鼠，不能抑制组织中细菌增殖而无保护作用。此外，单个基因片段似乎不可能产生与BCG完全相同的免疫效果，只有编码多个蛋白质抗原的DNA才可能产生超过BCG的持续性保护作用。虽然基因疫苗在体内表达的微量抗原蛋白能够激发个体的免疫反应，但很多情况下其强度仍弱于活疫苗，这一方面是由于疫苗DNA的转化效率有限，同时也因为基因疫苗在宿主体内不能像活疫苗那样自我复制。寻找合适的免疫佐剂是增强基因疫苗免疫活性的重要手段，某些细胞因子能提高DNA疫苗的免疫应答水平，如IL－2、IL－12或IFN－γ等，将能表达这些细胞因子的重组质粒与结核病DNA疫苗联合免疫，可提高免疫效果。Mtb多个基因联合或融合疫苗免疫可诱导更高的保护效力［12］。部分DNA疫苗在小动物模型上的效果比在人体内更有效，可能是由于小动物和人类理想的免疫刺激寡聚核苷酸不同所致。

结核病DNA疫苗不仅可作为治疗性疫苗，也可作为预防性疫苗的加强型疫苗。虽然DNA疫苗对人类长期疗效及安全性尚不清楚，但其制备及应用较简便，对于免疫低下者比BCG更安全。解放军第三〇九医院全军结核病研究所和上海海规生物科技有限公司联合研制的结核Ag85A DNA治疗性疫苗，目前在武汉生物制品研究所正在进行中试工艺研究［13］。国内外尚未见结核DNA疫苗进入临床实验的报道。

4.亚单位疫苗：其用 Mtb成分（如蛋白、多肽、枝菌酸、糖脂等）作疫苗组份，可诱导机体产生免疫保护或免疫治疗效果。其研制的关键在于保护性抗原和佐剂的选择、剂量的确定，选择抗原的主要标准是它们能否诱导保护性T细胞反应，保护人群抗结核。亚单位疫苗在安全性方面更容易被接受，故非复制的亚单位疫苗只要与BCG保护效力相当即可能用于人类临床实验。在Mtb早期培养滤液中有100多种蛋白，某些蛋白具有很强的免疫原性和较好的保护效率，如抗原85复合物、ESAT6蛋白、相对分子质量为38 000的脂蛋白、相对分子质量为65 000的热休克蛋白等。Mtb多种分泌蛋白混合或重组融合蛋白刺激的CD4＋T细胞反应和获得的保护效力均比单一蛋白成分强，但它们持续时间都较短。纯蛋白抗原所诱导的细胞毒性反应比BCG弱，提示纯化的蛋白疫苗的效力不如活的弱毒疫苗，但蛋白疫苗作为BCG免疫后的增强剂，保护效力明显强于单独BCG接种。然而，并非所有的蛋白免疫后都诱导保护性免疫，如α－晶状体球蛋白在休眠期增加表达，尽管具有免疫原性但无保护作用。

蛋白疫苗或多肽疫苗不加佐剂在动物体内很难引起免疫反应，同样的抗原加上不同的佐剂诱导的免疫反应、产生的保护效力也不同，只有诱导Th1型细胞免疫的佐剂才能增强亚单位疫苗的抗结核免疫。这类佐剂主要有二甲基三十六烷基铵氯化物（简称DDA）、去酰基单磷酸类脂A（简称 MPL）、DDA/MPL佐剂、DDA/TDB佐剂、RC－529佐剂、含Cp G基序的寡聚脱氧核苷酸（Cp G ODN，可提高BCG抗Mtb感染的效力2～5倍，但不能增强亚单位疫苗的抗结核作用）［14］。微球体疫苗是将抗原装入胶囊内或联结在微球体表面，装入胶囊内的抗原可避免酶降解和快速清除，并可控制抗原的释放。Evans等［15］建立的 Mtb 8.4蛋白微球体，其2 h后的释放率小于5%，48 h后小于10%，可持续、逐步地释放超过5周；1次免疫就能够诱导比MPL佐剂强的细胞免疫和体液免疫应答。至今尚无任何佐剂能使蛋白疫苗超过或达到BCG对动物的免疫保护效力。

丹麦国立血清研究所（SSI）研制的 Ag85BESAT6融合蛋白疫苗以IC31（寡脱氧核苷酸和多阳离子氨基酸的混合物）作为佐剂，在小鼠和灵长类动物的实验结果均显示其免疫保护力高于单一的ESAT－6或Ag85B蛋白疫苗，可增强BCG的免疫保护力，目前在进行Ⅱ期临床试验［16］。美国葛兰素公司（Glaxo－Smith Kline Biologicals，简称 GSK）研制的Mtb72f/AS02A嵌合蛋白疫苗，是由具有高度免疫原性的Mtb39和Mtb32基因重组构建的相对分子质量为72 000的嵌合蛋白，以MPL和皂角素QS21作为佐剂，豚鼠和猴子实验结果表明作为BCG加强免疫制剂，诱导的保护效力强于单独用BCG，目前在肯尼亚进行Ⅱ期临床试验［17］。AERAS、SSI、Sanofi和Intercell联合研制的AERAS－404/H4IC，是Ag85B和TB10.4融合蛋白疫苗，以IC31为佐剂，目前正在进行Ⅰ期临床试验［18］。解放军第三〇九医院和兰州大学研究的多种类型的蛋白疫苗，中国食品药品检定研究院研究的卡介菌Cp G复合佐剂－02系统，目前均处于临床前研究阶段。

四、新疫苗研制需要解决的问题

1.需阐明Mtb的致病机制和机体的免疫保护机制：（1）无论是BCG还是Mtb都不能诱发全面的特异性的免疫反应及足够强度的免疫回忆反应，只能诱导免疫抑制Mtb生长，不能完全清除体内的Mtb。然而90%的Mtb感染者终生不会发病的事实又表明结核自然感染所诱发的免疫反应能为大部分感染者提供有效的保护反应，若能清楚地了解个体发病或不发病的机制，了解Mtb抗原的生物学特性、转录、代谢通路，有的放矢地设计理想的疫苗，预防Mtb感染发病将成为可能。（2）宿主与 Mtb的相互作用复杂，目前研究显示结核患者的免疫应答呈现有利于Mtb的生存与传播。感染者是否发病是取决于Mtb的致病力、感染的菌量、个体的易感性，还是机体免疫系统是否遭到其他不利因素的影响？哪些免疫参数可作为疫苗有效性的评价指标？选择哪些指标来评价新疫苗更有意义（一般状况改善、菌落计数减少、细胞免疫功能增强、存活期延长）？（3）在结核高度流行区域，许多人已感染Mtb，甚至有亚临床病变，他们若接受强的免疫原，随后产生的宿主免疫反应是否会清除接种的疫苗？是否会激发潜伏的感染发生严重疾病？（4）部分人群感染了非结核分枝杆菌，这对未来的疫苗将会产生怎样的影响？

2.需开展合理的疫苗设计和免疫策略研究：（1）疫苗的设计既要针对增殖期的抗原（如Ag85A和Ag85B），也要针对休眠期的抗原，选择哪些抗原联合构建疫苗才有可能诱导更有效的保护性免疫应答？（2）亚单位疫苗在体内激发的免疫反应，在很多情况下其强度弱于活疫苗，需寻找合适的免疫佐剂增强其免疫活性。（3）新疫苗评价需要大量的人群和长期的随访观察，在BCG广泛接种的结核病高流行国家，选择大样本量的现场评估将遇到困难。而且，BCG将对新疫苗产生什么样的影响？BCG将如何与新疫苗联合免疫？新疫苗的类型、免疫的顺序、免疫的间隔时间、免疫的次数等免疫策略问题将是今后研究的重点之一。

3.需探索免疫治疗机制：结核病疫苗用于免疫治疗是一个新的探索领域，灭活的母牛分枝杆菌和草分枝杆菌制剂已在临床应用，治疗效果尚有争议，未达到“超短程化疗”的目的，其原因可能是灭活的细菌成分只能诱导短暂的Th1型细胞免疫应答，不能诱导特异的CTL应答，部分患者可能应用不当导致免疫耐受。但关键是目前尚未完全阐明结核病的免疫调节机制，结核病是一种感染性疾病，也是一种免疫疾病，结核免疫反应是一把双刃剑，如何应用免疫调节手段，从结核抗原致敏到机体免疫应答的各个环节进行免疫调节和免疫干预，促进其生理反应而抑制其病理作用，趋利避害，是今后需要进一步深入研究的方向。

临床前研究期间从动物模型上获得了一些基础免疫数据，但小动物和人类的免疫还是有一定的差异；临床医生对于疫苗能调动机体的免疫活性，辅助化疗杀灭、抑制细菌，清除在巨噬细胞内生存的间歇休眠菌、持留菌的认识不足；临床上免疫制剂的应用不够规范，对免疫制剂的用量、应用时机、疗程、应用对象的免疫状况及对患者免疫的影响等尚缺乏深入的研究。

4.需建立有效的疫苗评价模型：动物实验可为人类提供疫苗的安全性、免疫活性及有效性的评价，但并不能反映人类的免疫反应，尤其是长效型的免疫保护反应。如BCG在动物模型中具有很好的保护性，但近90年的人类应用效果并不理想。目前小动物、灵长类动物实验的结果将为人类有效疫苗的研制提供哪些有价值的依据？因此，有必要建立更有效的体内和体外疫苗评价模型。

随着科学的步伐只争朝夕地跨越，相信上述问题会得到圆满地解决。在过去的10年已有10种新型结核病疫苗进入Ⅰ期或Ⅱ期临床实验，均未出现安全问题或免疫病理发生，但预防性疫苗的临床实验周期长，还有一段较长的路要走。而治疗性疫苗的临床评价周期短，相信在不久的将来将看到新疫苗在结核病尤其是耐多药结核病患者的辅助治疗及潜伏感染者的预防治疗方面发挥作用。

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