植物类甜蛋白基因家族研究进展

姜晓玲，黄秋娴，李 虹，赵嘉平

(1.河北农业大学 林学院，河北 保定 071001；2.中国林业科学研究院 林业研究所，北京 100091；3.北京林业大学 林学院 省部共建森林培育与保护教育部重点实验室，北京100083)

病程相关蛋白(pathogenesis-related proteins，PRs)由植物PRs基因编码，最早从烟草Nicotiana tabacum花叶病毒(tobacco mosaic viru，TMV)侵染的烟草叶片中发现，依据氨基酸组成、生物化学和血清学特性，将PRs分为17个不同的蛋白家族，即PR-1～PR-17[1]。由于 PR-5蛋白家族的氨基酸序列与西非灌Thaumatococcus daniellii甜蛋白(thaumatin)的氨基酸序列高度同源，因此又被称为类甜蛋白(thaumatin-like proteins，TLPs)[2]。研究表明:TLPs与植物的抗逆反应有关，当植物受到病原物(真菌、细菌、病毒等)，化学因子(乙烯、水杨酸、氨基酸衍生物、重金属离子等)，物理因子(紫外线、热处理、机械损伤等)以及特定的生理因素 (衰老、开花、质壁分离等)诱导时，TLPs基因在植物体特定部位迅速表达并积累。许多研究发现植物TLPs具有显著的抗真菌活性，一些转TLPs基因的植物对于真菌性病害的抗性也显著增强[3]，因而近年来，TLPs的抗真菌功能在植物病理学研究中受到越来越广泛的关注。作为具有较高利用价值的潜在遗传资源，TLPs基因也在植物抗病育种中展现出了广阔的应用前景。笔者将从TLPs基因的起源分布、结构特征、表达特征和 TLPs的生理功能出发，分析TLPs基因的研究前景及在植物抗病育种中的应用趋势。

1 类甜蛋白(TLPs)基因的分布、起源及进化特征

TLPs分布广泛，不但存在被子植物、裸子植物和苔藓植物中，而且存在于线虫[4]、节肢动物[5－6]以及真菌[7－8]中。在植物中，TLPs 分布于不同的细胞或组织中。Léon-Kloosterziel等[9]发现在无致病性假单胞杆菌的作用下，AtTLP1基因在拟南芥Arabidopsis thaliana根部维管束特异性表达；而在转基因拟南芥中，由CKTLP和绿色荧光蛋白构成的融合蛋白在细胞外或细胞壁上表达[10]。也有研究表明:一种特定的杨树TLP1蛋白在有明显维管系统(例如中脉，叶柄和茎)的组织中表达，而另一种TLP主要在嫩叶和枝条尖部的淀粉储藏质粒体中表达[11]。

植物基因组中的TLPs基因以基因家族的形式出现，如模式植物杨树、拟南芥、水稻Oryza sativa基因组中分别有 55 个[12]、24 个[12]、30 个基因[6]。不同于动物和真菌的单系 TLPs基因类群[13]，系统发育分析表明植物 TLPs基因家族是一个由10个类群构成的复系类群，这10个类群分别起源于单子叶与双子叶植物分化之前的10个祖先序列。在植物漫长的进化过程中，经过染色体复制、基因复制、基因转换以及突变最终在不同的植物中形成为数目不一的基因家族[13－14]。与植物PR1基因家族、β-1，3-葡聚糖酶类似，具有抗微生物活性的TLPs被认为是植物天然免疫系统的组成之一[15]，考虑到TLPs基因的古老起源、广泛分布以及之后在漫长的进化历史中的频繁发生基因复制事件，这些都预示着TLPs在植物抗逆反应中的重要作用，而且研究证明 TLPs基因的适应性进化过程仍然在持续[16]，预期植物尤其是木本植物 TLPs基因家族还会随着环境胁迫压力发生一定程度的适应性进化。

2 TLPs的结构特征

TLPs最为重要的结构特征在于其分子中由16个半胱氨酸残基配对形成的8个二硫键，由于这些二硫键的存在，使得 TLPs具有了相对稳定的化学结构，能够抗热，抗酶解和抗酸碱[17－19]。一些 TLPs含有N端信号肽，用于引导成熟的蛋白到分泌路径。逆渗透蛋白(osmotin)和植物OLPs还具有C端前导肽，用于引导蛋白到达液泡[20]。

TLPs分子的三级结构一般由3个结构域构成，结构域Ⅰ由11个β片层(β-sheet)反向平行折叠形成，结构域Ⅱ和结构域Ⅲ主要由α螺旋区域构成[21－23]，而结构域Ⅰ和结构域Ⅱ之间形成一个具有强烈电负性的裂缝(cleft)[23]。然而也有一些特殊的 TLPs，其三级结构只具有结构域Ⅰ和结构域Ⅱ，甚至有些TLPs仅仅包含结构域Ⅰ，因此，植物TLPs的分子量大小不等，一般为16～40 kDa，然而不论分子量如何变化，TLPs的氨基酸序列高度同源，并且具有相似的生理学特征。

3 TLPs的生理功能

3.1 抗真菌活性

抗真菌活性是TLPs的主要功能之一。TLPs参与多种植物病原真菌侵染之后的主动防御反应，如水稻纹枯病菌 Rhizocotonia solani的侵染可诱导水稻 TLPs基因表达，增强它对该病原菌的抗性[24－25]；烟草逆渗透蛋白具有裂解致病疫霉Phytophthora infestans孢子，抑制菌丝生长的功能[26]。牛心朴子Cynanchum komarovii CKTLP对轮枝菌属Verticillium dahliae，尖孢镰刀菌Fusarium oxysporum和丝核菌Rhizoctonia solani等真菌生长有抑制[10]。葡萄Vitis vinifera藤TLPs(VvTLP-1)在体外能明显抑制痂囊腔菌属 Elsinoe ampelina 孢子的萌发和菌丝生长[27]。

林木受到病原物侵染之后也有类甜蛋白产生。Zamani等[28]从花旗松Pseudotsuga menziesii中分离了第一个林木类甜蛋白(PmTLP)，Western blot显示该蛋白在受真菌感染的根部比非感染区域含量显著增高，说明该蛋白参与寄主抗真菌防御反应。研究还表明:该蛋白可能具有阻止真菌在树木体内进一步扩展的作用。Piggott等[29]发现茶藨子生柱锈菌 Cronartium ribicola可诱导西部白皮松类甜蛋白 Pin mTLP在受感染植株干部周围表达，Pin mTLP的表达对松树疱锈病Cronartium ribicola的发展有一定抑制作用。

研究表明:植物TLPs主要通过裂解真菌孢子，抑制孢子萌发，降低幼嫩菌丝活力等方式对致病和非致病真菌产生抑制作用[26，30－33]。并且转TLPs基因植物能够延缓多种真菌病害发展过程，如葡萄孢Bostrytis sp.，镰刀菌 Fusarium sp.，丝核菌 Rhizoctonia sp.，核盘菌Sclerotinia sp.等引起的病害发展过程，增强转基因植物对病原真菌的抗性[34－38]。

3.2 β-1，3-葡聚糖酶活性

Grenier等[7，39]发现许多不同来源的 TLPs具有 β-1，3-葡聚糖酶活性。大麦 Hordeum vulgare的 TLPs具有 β-1，3-葡聚糖酶活性，能够结合并水解 β-1，3-葡聚糖[39－42]。苹果 Malus pumila 和樱桃 Prunus avium中的 TLPs也具有中等的β-1，3-葡聚糖酶活性[42]。Martin等[43]研究显示:一些发病的真菌和另外一些丝状真菌分泌的葡聚糖酶能够降解真菌细胞壁。研究发现:烟草 TLPs的β-1，3-葡聚糖酶活性与蛋白质分子表面的酸性裂缝中的2个保守的酸性氨基酸残基有关[44]。通过蛋白质建模以及功能分析，笔者发现:部分杨树TLPs中也有保守性的Glu92-Asp110氨基酸残基存在，并且这2个残基中的活性氧原子处于催化活性发挥的正确位置，因此，认为部分杨树 TLPs也具有β-1，3-葡聚糖酶活性[9]。研究表明:这个结构与TLPs的生理功能有密切联系。

然而，相对与真正的β-1，3-葡聚糖酶催化位点之间的较短距离[45]，杨树，玉米Zea mays，草莓Fragaria ananassa等 TLPs分子的催化位点之间较长的距离[16]，可能解释了 TLPs的β-1，3-葡聚糖酶活性较低的事实，因此，Menu-Bouaouiche等[42]认为，仅仅TLPs本身可能无法直接通过破坏真菌细胞壁，而是通过β-1，3-葡聚糖酶反应的产物来诱导植物的防御反应进而抵抗真菌的侵染。

3.3 其他活性

除了抗真菌活性和β-1，3-葡聚糖酶活性外，许多研究还发现 TLPs具有酶抑制剂活性。来自玉米的抗真菌蛋白(zeamatin)是较早被鉴定出的具有淀粉酶抑制剂活性的 TLPs[30，46]。抗真菌蛋白通过抑制昆虫淀粉酶活性，阻碍昆虫消化吸收食物中的碳水化合物,减少糖分摄取，造成昆虫营养不良和能量不足，进而导致昆虫死亡。因此，Franco等[47]建议利用具有а-淀粉酶抑制剂活性的 TLPs来控制象鼻虫(weevils)等以淀粉为主要食物的有害生物。

一些植物果实和花粉中的TLPs具有植物过敏原活性。第一个被鉴定出具有过敏原活性的 TLPs是来自苹果的 Mal d 2[48]。并且 Krebitz等[49]发现重组的烟草花叶病毒在烟草中表达的 Mal d 2也具有过敏原活性。继 Mal d 2 之后，又从甜椒 Capsicum annuum[50]，樱桃 Prunus arium[51]，猕猴桃 Actinidia sp.[52]，葡萄[53]和 香蕉Musa supientum[54]的果肉中分离出具有过敏原活性的 TLPs。由于果实中含有大量水分和甜味物质，很容易被真菌或昆虫侵袭，因此，Hoffmann-Sommergruber[55]认为:组成型表达于特定发育阶段的 TLPs可以对果实起到快速保护作用。也有研究者从杜松Juniperus ashei[56]，绿干柏Cupressus arizonica[57]和日本柳杉 Cryptomeria japonica[58]的花粉中分离出具有过敏原活性的 TLPs Jun a 3，Cup a 3，Cry j 3。此外，引起人类过敏症的过敏原中也包括TLPs，Palacín等[59]在研究中发现桃子Prunus persica中的3种 TLPs是桃的首要过敏原。Lehto等[60]发现小麦中的 TLPs是与面包房哮喘相关的最新的过敏原。笔者发现:部分杨树 TLPs具有过敏原活性，并且这些TLPs多数在美洲黑杨及青杨花粉中表达(待发表)。因此，春季杨树花粉中特定TLPs基因的表达可能是造成部分人群过敏的原因之一，然而过敏原活性对于杨树、松树等的生理意义仍是值得深入探讨的问题。

一些研究者发现:植物 TLPs还具有抗冻活性,木聚糖酶抑制剂活性和抗虫活性。Hon等[61]通过氨基末端序列比较，免疫交叉反应和酶活性分析，在冬黑麦Secale cereale的叶片质外体中分离出2个具有抗冻活性的 TLPs(25 kDa和16 kDa)；最近的研究发现一种来自小麦的新型木聚糖酶抑制剂(TLX1)属于TLP家族，重组的TLX1蛋白对长枝木霉Trichoderma longibrachiatum木聚糖酶XynI有抑制活性[62]；新近研究表明:被麦二叉蚜Schizaphis graminum取食后，高粱Sorghum vulgare TLPs基因上调表达，因此，证明TLPs与植物抵御昆虫反应有关[63]。

4 TLPs的抗真菌机制

虽然已有很多关于TLPs抗真菌活性的报道，但是植物TLPs抗真菌病害的详细分子机制还不明确。由于玉米类甜蛋白抗真菌蛋白可以导致链孢霉Neurospora crassa细胞的快速裂解，而烟草逆渗透蛋白也能够导致白色念珠菌Candida albicans细胞内容物迅速外溢而致死。因此，早期研究认为:植物TLPs促使真菌细胞膜形成小孔，从而使水流入，进而引起细胞渗透破裂，来达到抗菌目的[20，26]。然而，结构分析表明: 抗真菌蛋白和逆渗透蛋白并不具有导致细胞膜孔洞形成的特征[26，33]。

Menu-Bouaouiche等[42]认为: TLPs结构域Ⅰ和结构域Ⅱ之间的酸性裂缝与抗真菌活性有关[64－66]。然而，Chan等[67]发现冬黑麦Secale cereale中的 TLPs只具有结构域Ⅰ中的酸性残基，没有裂缝结构，也具有抗真菌活性。所以，他们认为TLPs结构域Ⅰ中的酸性残基与真菌细胞膜上的水通道蛋白、离子通道蛋白和渗透感受器之间的相互作用，使得TLPs具有了抗真菌活性。通过适应性进化和蛋白质三级结构分析，Zhao和 Su[16]进一步证明了杨树 TLPs分子表面酸性裂缝与抗真菌活性之间的相关性。

另外，TLPs的裂缝区域是一个典型的碳水化合物的结合位点，Osmond等[40]用实验证明 TLPs与线性β-1，3-葡聚糖的结合发生于裂缝区域，裂缝区域内的几个残基与真菌细胞壁的碳水化合物形成氢键，并且芳香族氨基酸在裂缝处参与形成堆积力共同破坏了真菌细胞壁的结构，使TLPs与细胞膜接触，造成真菌细胞死亡。改变细胞壁结构是 TLPs抑制真菌侵染的先决条件。TLPs除了与细胞壁上的 β-1，3-葡聚糖特异性结合改变细胞壁结构外，还可以通过其他的途径改变细胞的结构。烟草逆渗透蛋白能够诱导酵母有丝分裂过程中的促细胞分裂原活化蛋白激酶(MAP-kinase)的表达，通过改变细胞壁结构使逆渗透蛋白能够与细胞膜接触而导致细胞死亡[68]。

TLPs的抗真菌机制不仅与真菌细胞壁破坏和真菌细胞膜透性改变有关之外，还与木质素，植保素等抗性物质的合成以及抗性结构的形成有关，植物TLPs表现的抗真菌活性很可能是与这些防御机制协同作用的结果。

5 TLPs基因的表达

TLPs基因一般在植物特定组织、器官中低水平组成型表达，而且表达活性不同。如草莓TLPs基因在叶和花冠中表达量最多，在根中表达量中等，在未成熟果实中表达量最少[69]。受到外界逆境胁迫后，TLPs基因的表达可以迅速上调。研究表明:被麦二叉蚜取食的高粱中TLPs基因的转录增加几千倍[63]。草莓Fragaria ananassa受到脱落酸胁迫6 h后，体内TLPs表达量为最初表达量的8.8倍；受水杨酸胁迫48 h后，TLPs基因表达量为最初的30.5倍；而机械损伤可以诱导其 TLPs表达量增加7.8倍[69]。

TLPs基因的表达与植物生长环境(生长状态)和植物抗病性有关。植物生长状态方面，如雪松Cedrus deodara花粉中具有过敏原活性的 TLPs在不同年份的含量差别高达5.0倍以上[70]。大麦和燕麦Avena sativa从子房壁发育到糊粉层的过程中，TLPs基因的表达发生了改变[71]。一种胡椒TLP基因也是在果实成长过程中表达[72]。一种葡萄糖甘酸酶启动子聚变(融合)研究发现日本梨Pyrus serotina的TLP基因(PsTL1)特定的在雌蕊和花药中低水平表达，但是在其他花器官和叶子中没有表达[73]。植物抗病性方面，小麦冠腐病菌Fusarium pseudograminearum侵染4 d后，小麦抗病品种中TLPs基因表达显著高于感病品种[74]。林木中，Petre等[13]最近发现杨树TLPs基因的表达可能与杨树对于杨栅锈菌Melampsora sp.的抗性有关。然而，也有一些TLPs基因对病原菌胁迫不敏感，而在植物受到生理、化学或物理因素诱导时大量表达。例如:有些 TLPs基因只有在植物的某些发育阶段的特定器官，如检测到 Ban-TLP，Mal-TLP和Pru-TLP在香蕉、苹果以及梨的果实中高量表达[42]。

最新研究显示:在TLPs基因表达受启动子调控。启动子中的沉默子会抑制防御反应中生姜Zingiber officinale TLPs(ZoPR5)的表达。启动子中的GT-1 box和TGTCA可以激活植物防御反应中林亡果姜Curcuma amada TLPs(CaPR5)的表达[75]。

进一步分析研究表明: TLPs基因家族的特定成员在特定条件下的表达模式并不相同。笔者的研究表明:室温光照培养条件下，杨树TLPs基因的55个成员中，有37个基因至少在根、成熟皮、嫩皮、成熟叶、嫩叶5个部位中的1个部位表达，而仅有4个基因在全部5个部位同时表达，并且这些表达的基因分布在除类群9之外的9个不同的系统发育类群中；同时初步研究表明:类群5及类群6中的多数TLPs基因的表达与真菌侵染存在相关性(未发表)，考虑到系统发育特征，因此以往研究中 TLPs基因的复杂多样的表达特征以及功能特征可能是 TLPs基因家族不同成员的特征的集合，对于植物 TLPs基因的功能需要在全基因组水平上进行细致的研究，目前，杨树 TLPs基因的差异表达模式及TLPs基因家族不同成员的功能验证工作正在进行中。

6 TLPs基因在植物抗病育种方面的应用

由于具有有效的抗真菌作用，TLPs基因现已被应用到多种作物的抗真菌基因工程中，并且取得了理想的效果。Kuwabara等[76]克隆了冬小麦taTLPs基因，其表达蛋白在低温下能够抑制小麦雪霉叶枯病菌Microdochium nivale菌丝的生长，增强冬小麦的雪霉病抗性。研究显示:小麦TLPs基因的表达可以减轻由Fusarum pseudograminearum导致的小麦冠腐病症状[74]。另外，将水稻TLP基因转入小麦中，可增强小麦对小麦禾谷镰刀菌F.graminearum的抗性[35]。超量表达的CKTLP明显的提高了拟南芥对轮枝菌Verticillium dahliae 的抗性[10]。

组成型表达逆渗透蛋白的转基因烟草对交链孢菌Alternaria sp.的抗性得到明显增强[77]。转逆渗透蛋白基因的马铃薯Solanum tuberosum，晚疫病症状减轻，抗病性得到增强[37]；超量表达类似逆渗透蛋白(osmotin-like)的转基因马铃薯对致病疫霉的抗性增强[3]。

组成型表达TLPs的转基因水稻抗真菌能力明显增强[78]；在籼稻优良品种中超量表达水稻TLPs基因增强了其对水稻纹枯病致病菌 Rhizoctonia solani和水稻叶鞘腐败病菌Sarocladium oryzae的抗性[79]。将水稻 TLPD34导入匍匐剪股颖 Agrostis palustris中，能够增强其对币斑病菌 Sclerotinia homoeocarpa的抗性[25]。重组龙葵 Solanum nigrum TLPs(SnOLP)在体外对 Fusarium solani f.sp.glycines，Colletotrichum spp.，Macrophomina phaseolina和Phytophthora nicotiana var.parasitic等植物病原真菌的生长均具有抑制活性[80]。TLPs基因已经在多种植物中成功表达，转基因植物显示的对于多种病原真菌的抗性揭示培育转TLPs基因植物将是植物抗病育种的有效途径之一，然而在林木TLPs基因的遗传转化仍未见报道。

7 问题与展望

对于植物TLPs基因家族，虽然在其结构，生理功能等方面已经有了大量的研究，在植物转基因抗病育种中也有了一些较为成功的应用实例，但在 TLPs的功能、TLPs诱导植物抗性的信号传递、与TLPs基因有关的多基因聚合育种等方面仍有许多问题有待深入探讨。首先，如前所述，虽然TLPs是与抗真菌有关的许多特性已经得到证明，但是TLPs抗真菌活性的核心机理有待进一步阐明，而这将会对TLPs分子功能的定向设计奠定基础，从而有利于TLPs抗真菌功能的进一步发挥。其次，植物TLPs基因家族是由10个具有共同起源的旁系类群构成，不同类群内的 TLPs基因高度分化，而已经报道的TLPs基因多数属于类群5和类群6，其他类群的 TLPs是否具有相近的功能，或者说TLPs的不同分支是否对应于不同的生理功能，这仍然是一个需要深入研究的课题。第三，研究发现:在不同的条件下，植物特定 TLPs基因的表达分别与茉莉酸(JA)，乙烯(ET)及水杨酸(SA)信号传导途径有关，而病原菌胁迫过程中，茉莉酸以及 水杨酸信号传导途径分别与酸性以及碱性 PR蛋白有关[81]，然而具体到TLPs基因家族，诱导酸性、碱性TLPs产生的信号传导机制仍然不明确。对于以上问题的探索，将会有助于对外来生物或非生物胁迫出现时，植物天然免疫系统发挥免疫作用细节的了解。第四，基于TLPs基因家族的功能特性，显而易见，通过研究真菌病害过程中TLPs基因的表达特征，探讨TLPs与林木抗病性之间的联系，发现有效地林木抗病性相关TLPs基因并实现遗传转化，将是当今林木病理学和遗传育种研究中的重要内容之一。另外，由于已经发现很多TLPs与人体的过敏反应有关，因此，林木，尤其对于在中国具有广泛栽植面积的杨树、松树所引起的过敏性疾病的防治不仅是一个亟待解决的公共卫生课题，也是林木遗传育种研究中需要引起关注的重要问题。

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