浅谈植物多倍体鉴定方法

张红亮，姚先玲，李 霞，孙 晶

（山西省农业种子总站，山西 太原 030006）

细胞染色体作为植物遗传基因的主要载体，其倍数性的变化是导致植物产生较大遗传变异，产生性状变化的重要途径。人为采取各种物理、化学、生物等方法可以促使植物细胞染色体成倍数性增加，从而改变植物遗传性状、提高抗逆性、提高产量和有效成分含量，这种方法称为多倍体育种[1]。这是一种有效的育种方法，一方面可诱导多倍体作遗传桥梁，把一些其它性状好但育性差、无法进一步进行杂交利用的奇数倍植株经过加倍后育性正常，为常规杂交育种提供抗源材料；另一方面，通过染色体加倍，可能得到优质、高产、抗病虫等优良性状的新品种，这些已在葡萄、柿等多种果树的多倍体育种中得到验证[2]。近几年，各国研究者对许多植物进行了广泛的多倍体研究，包括果树、蔬菜、花卉、中药材、草类等。现将植物多倍体鉴定方法综述如下：

1 染色体鉴定法

1.1 染色体制片法

染色体制片法是进行细胞倍性鉴定最直接、最可靠的方法，计数准确，而且不需要复杂的实验仪器，是目前应用最多的鉴定方法。用秋水仙素诱导GCTCV-119香蕉多倍体，经根尖染色体数目检测，在外部形态上没变化的植株，其根尖染色体数目一般为 33（2n=3x=33）条，而在外部形态上表现为假茎、叶柄粗壮、叶片肥厚、变圆或皱缩扭曲的植株基本上都加倍了，但多数为嵌合体。加倍了的细胞染色体数目为66（2n=6x=66）[2]。

1.2 流式细胞仪鉴定

流式细胞术是一项现代化的DNA倍性分析的高新技术，通过对细胞的光散射和不同荧光的多参数同步测定，可对单细胞的倍性进行快速精确的分析。该方法最突出的特点是测量快速，已被成功地用于玉米、向日葵、甘薯、猕猴桃、李、番茄、苹果、草莓的倍性鉴别上。研究者对13个二倍体苹果品种和5个三倍体苹果品种核DNA含量测定结果表明，三倍体为二倍体的1.38倍[3]。

1.3 染色中心直径和异染色质数目鉴定法

韩毅科等[4]在研究中发现，不同倍性黄瓜染色中心的直径和异染色质的数目差异显著，与植株倍性呈正相关。其中单倍体染色中心直径平均为5.1 μm，双单倍体为13.3 μm；单倍体异染色质数目平均5.0，双单倍体为11.9。

2 形态特征鉴定法

2.1 叶片形态

四倍体黄瓜的部分器官表现出“巨大性”，叶面积均比二倍体的大，差异显著或极显著。随着染色体成倍增加，叶片逐渐变厚，叶缘逐渐变皱褶，叶色逐渐加深[5]。经秋水仙素诱导后形成的桔梗多倍体植株与原二倍体植株比较，在形态上，多倍植株叶片变宽变大，叶色变深，茎变粗且节距长[6]。四倍体三色堇形态特征十分明显，表现出叶色浓绿，叶片肥厚[7]。

2.2 叶片保卫细胞叶绿体数目及叶片气孔大小

对三倍体和六倍体香蕉叶片气孔保卫细胞叶绿体数目进行观察，结果表明，加倍后叶绿体数目明显增加，大约为加倍前叶绿体数目的2倍[2]。通过FDA荧光法观察，西瓜四倍体、三倍体、二倍体叶片保卫细胞中的叶绿体数目分别为 19.9±3.4、15.9±2.2、11.5±1.5，其比例约为 4∶3∶2，与西瓜的倍性一致[8]。叶片气孔鉴定可作为多倍体鉴定的间接方法。试验表明，桔梗多倍体（即四倍体）气孔增大而单位叶面积气孔数目减少，气孔明显大于二倍体气孔，鉴定结果较可靠[6]。

2.3 花特征鉴定法

单倍体、二倍体、四倍体黄瓜的雌花随倍性的增加而变大；二倍体和四倍体的雄花逐渐变大，花瓣表面和边缘逐渐变皱折，花色渐深；单倍体的雄花在开放前黄化败育。四倍体雌花子房上的果刺比二倍体的粗密，而单倍体的则较细疏[5]。四倍体三色堇花朵巨大、花瓣厚而挺、香味浓、花色艳丽、花斑大、气孔和花粉粒巨大，使得四倍体三色堇的观赏价值大为提高[7]。

3 条件鉴定法

包括高温胁迫法和低温胁迫法，其原理是利用植物在不同的实验条件下生理状态不同进行倍性鉴定。郭启高等[9]在西瓜子叶离体组织培养中利用西瓜二倍体和四倍体对高温和低温的不同反应进行倍性鉴定。他们确定，50℃持续10 h为高温胁迫的临界点，0℃持续5 h为低温胁迫的临界点，通过此方法鉴定的倍性符合度为90%和80%。

4 同工酶鉴定法

同工酶作为植物界存在的一种普遍现象受到了广泛的研究，并且应用于植物遗传育种等方面，一般随染色体倍性的增加同工酶活性降低。陈清华等[10]曾用过氧化物酶和酯酶同工酶来鉴定二倍体 （2X）、三倍体（3X）、四倍体（4X）西瓜。结果表明，四倍体的酯酶活性要比二倍体低；而无籽西瓜组合母本的谱带与F1差异较明显。

5 杂交鉴定法

研究者在西瓜中利用反交法，以待鉴定的诱导植株为母本、已知二倍体植株为父本进行套袋隔离杂交，单瓜留种。若所结种子为具有种胚的正常种子，说明被鉴定株是未变异的二倍体植株。若所结种子为不具种胚的空壳种子，说明被鉴定植株是发生变异的四倍体植株。

综上可见，多倍体鉴定方法有多样性，而各种方法优缺点不一。利用形态学性状来鉴定倍性的优点是简便快速，且实用性强，较易掌握该测定方法，准确率也较高，不足之处是经验因素过多，可能会因人而异。而染色体鉴定法、同工酶鉴定法简便、快速、准确，但缺点是技术难度大。而条件鉴定法、杂交鉴定法需耗费更多的时间和劳力，实际研究中应用较少。因此，在多倍体研究中，要针对不同作物的特点综合考虑，多管齐下，才可能准确鉴定选择出多倍体。

[1]张旺凡，汪友蓉.多倍体育种技术在药用植物领域应用进展[J].中医药导报，2006，12（2）：83 ～ 85.

[2]胡玉林，谢江辉，郭启高，等.秋水仙素诱导 GCTCV-119香蕉多倍体[J].果树学报，2006，23（3）：462 ～ 464.

[4]韩毅科，杜胜利，王鸣.黄瓜染色体制片及倍性研究[J].华北农学报，2003，18（1）：72 ～ 74.

[5]雷春，陈劲枫，张晓青，等.不同倍性黄瓜的形态和一些生理生化指标比较[J].植物生理学通讯，2005，41（4）：471 ～ 474.

[6]王小华，熊丽，屈云慧.中国桔梗多倍体诱导与鉴定[J].云南植物研究，2006，28（6）：593 ～ 598.

[7]郑思乡，胡秀，雷小云，等.离体培养条件下三色堇多倍体诱导研究[J].云南农业大学学报，2003，18（4）：397 ～ 400.

[8]刘文革，阎志红，饶小莉.不同倍性西瓜的叶表皮微形态特征比较[J].果树学报 2005，22（1）：31 ～ 34.

[9]郭启高，宋明，杨天秀，等.西瓜试管苗中四倍体鉴定方法研究[J].西南农业大学学报，2000，22（3）：261 ～ 263.

[10]陈清华，彭庆务，黄涛，等.西瓜过氧化物酶、酯酶同工酶酶谱及其利用研究[J].广东农业科学，1998（2）：22 ～ 24.