中心体蛋白的肿瘤学应用研究进展

刘 琪， 李同义， 于志勇

中心体蛋白(ninein-like protein, Nlp)是γ-微管蛋白复合物结合蛋白家族(GTBPs)中的一员，是有丝分裂过程中必不可少的成分[1]。Nlp的主要功能是促进微管成核，从而促进中心体成熟、纺锤体形成和染色体分离。近年来，诸多研究发现Nlp在乳腺癌、肺癌、宫颈癌、卵巢癌、头颈部鳞状细胞癌等上皮肿瘤中过度表达，其有可能作为癌症临床诊断的潜在生物学标志物和治疗新靶点。本文就目前国内外Nlp的相关研究进展进行综述。

1 Nlp在细胞有丝分裂中的作用

Nlp为细胞主要微管组织的中心，在细胞周期中调节细胞极性、粘附和活动性，在有丝分裂过程中促进微管组成。在有丝分裂阶段的开始，每一个中心体都有一对中心粒植入到无定形的中心粒外周物质，经过结构和功能重组，促成中心体成熟[2]。重组过程的主要特征在于γ-微管蛋白的聚集，包括中心体复合物和微管蛋白成核性能的共同增长，此时主要的中心粒外周物质组分会大量改变[3]。许多蛋白激酶和磷酸酶，包括polo-样激酶1(plk1)，有丝分裂酶A(Aurora A)和相关性激酶2(Nek2)，蛋白磷酸酶4也与中心体成熟的调节有关[4]，但是这些促进中心体成熟的酶底物尚未完全确定。在哺乳动物细胞中，Nlp以依赖细胞周期的方式表达且在G2/M转化时达到高峰。Nigg等[5]研究表明Nlp在G2/M转换时需要从成熟的中心体中移除，Nlp在G2/M转换中的磷酸化作用能使其从中心体分离，这是中心体与有丝分裂纺锤体的形成的关键步骤。多数动物细胞和酵母菌的大部分微管蛋白从微管组织中心成核，尤其是中心体和纺锤体极体。这个过程主要取决于γ-微管蛋白的四级结构的聚集，只有在微管组织中心聚集之后才能被激活[6]。但是这些复合体被召集到中心体的机制仍未发现。在大多数情况下，γ-微管蛋白复合体结合蛋白的行为应该像γ-微管蛋白复合体接收器一样并且有助于微管蛋白成核[7]。到目前为止，只有一小部分的γ-微管蛋白复合体结合蛋白被识别，即在较低等的生物或者脊椎动物，尤其是在酿酒酵母的Spc72 (spindle pole body component of 72 kDa)和Spc110 (spindle pole body component of 110 kDa)中[8]。Casenghi等[9]发现动力蛋白-动力蛋白激活蛋白复合体能够将Nlp植入中心体。通过Plk1的负调节、磷酸化促进中心体Nlp的释放，可防止中心体通过动力蛋白-动力蛋白激活蛋白动力复合体再提供Nlp。

2 Nlp与肿瘤形成的相关性

2.1 Nlp在肿瘤组织中表达 有丝分裂过程的终止会导致细胞发生不同程度的转化[10]。有丝分裂成分的异常，比如plk1、Aurora-A、survivin、cycling B1和Nek2都与肿瘤生成和病情进展密切相关。上述蛋白质在各种人类肿瘤中常表现出基因扩增或者无控制表达。有丝分裂的缺陷与中心体的畸形密切相关，包括结构改变，如中心体数量增加、体积增大以及中心粒外周物质的增加；多余的中心粒以及功能的缺陷，比如微管聚集性增强[11]。中心体异常可能发生在肿瘤生成的早期阶段这一观点已被广泛接受，诸多研究认为中心体异常应该是基因不稳定的主要原因[12-15]，其会导致恶性肿瘤的发生[16-18]。然而，中心体异常导致肿瘤发生和恶性过程的潜在机制还需要进一步确定。Shao等[10]通过荧光检测和印迹技术分析显示转基因动物中Nlp的表达。外源性Nlp的表达在大多数组织中都能检测到，比如肺、肾脏、乳腺、胸腺、睾丸及皮肤等。对转基因小鼠与正常小鼠进行射线处理，结果发现，Nlp转基因小鼠接受射线处理后，在20周时发现第1例淋巴瘤，在第28周时有8只小鼠发生淋巴瘤，但是正常组第24周时才发现第1例淋巴瘤，在第28周2只鼠发生淋巴瘤。转基因小鼠和正常小鼠接受射线处理后发生淋巴瘤情况的比较具有统计学意义(P=0.03)。然而，在第32周，20只转基因小鼠中的12只和20只正常组中的8只发现患有淋巴瘤。此外，Nlp转基因小鼠中发生的淋巴瘤恶性程度更高并且具有侵袭性。接受射线处理的正常小鼠组，淋巴瘤只是在胸腺，较小地侵袭周围器官，而在转基因小鼠中，大多数淋巴瘤不仅仅在胸腺，还非常易于侵袭心脏和肺组织。因此，转基因小鼠更易受射线诱导发生肿瘤。从Nlp转基因小鼠和正常小鼠中分离出来的MEFs(mouse embryonic fibroblasts)接受射线处理，进而行细胞凋亡分析，22%来源于正常小鼠的MEFs发生细胞凋亡，7%来源于转基因小鼠的MEFs出现细胞凋亡。UV处理后，12%来源于正常组织的MEFs发生细胞凋亡，5%的转基因小鼠MEFs发生细胞凋亡。这说明Nlp的过度表达会明显减弱DNA损伤诱导的细胞凋亡。

2.2 Nlp诱导细胞转化 正如前述，肿瘤组织Nlp的基因扩增，Nlp mRNA和蛋白质表达增加。研究中Nlp过度表达时表现出强大的转化能力，Shao等[10]亦进行了相关的列研究，其将pEGFP-Nlp表达载体转染到NIH3T3啮齿类动物的纤维母细胞以其获得性高表达Nlp的细胞中，使用合并的克隆体(3T3-Pool)和独立的克隆体(3T3-53, 3T3-58, 3T3-78)对肿瘤发生进行分析，这些同基因细胞系与亲代NIH33T3细胞或者转染空pEGFP载体的细胞相比，表现出快速增长的特性。混合的克隆体和所有表达Nlp的3个同基因的细胞系当在琼脂上生长时形成大量体积大的克隆体。然而，其母代NIH3T3和转染空载体的细胞仅仅形成极少的微小的克隆体，这表明Nlp给予细胞非依赖生长的特性。随后，其将表达Nlp的NIH3T3经皮下注射到60只裸鼠中，58只形成肿瘤，另外10只注射对照细胞的小鼠都没有出现肿瘤。HE染色表明肿瘤经过分化在组织上会变成肉瘤，免疫组化表明肿瘤的Nlp染色呈强阳性。动物死后将异种移植物移除，将基因组的DNA从肿瘤中分离出来，并用PCR检测小鼠Nlp和人类Nlp基因。结果正如阳性对照组，小鼠Nlp基因在MEFs中检测到，人类Nlp在HeLa细胞系中检测到。小鼠Nlp和人类Nlp都在异种移植物中发现。这些结果进一步证实，异种移植物来源于Nlp表达的NIH3T3小鼠纤维细胞。这些发现表明，Nlp是具有致癌性并且能够诱导细胞转化。

3 过度表达Nlp的人体肿瘤

3.1 头颈部鳞状细胞癌(HNSCC) Yu等[19]首次分析了Nlp蛋白在HNSCC肿瘤组织中的表达，用免疫组化的方法检测了76例临床肿瘤样本和68例正常邻近组织样本。结果在76例HNSCC样本中有50例(65.8%)发现Nlp蛋白呈阳性或者强阳性细胞质染色，26例(34.2%)弱或者阴性染色(0～1分)；在正常周围组织中仅3例表现为Nlp蛋白染色阳性。与免疫组化分析一致，通过印迹技术发现，20例肿瘤样本中有14例与其对应的正常组织相比表现出Nlp过度表达。实时RT-PCR技术发现在原发性HNSCC样本与其正常周围组织对比中有较高的Nlp mRNA表达。在所有样本中，比较肿瘤与非肿瘤组织中Nlp mRNA的倍数变化(0.175～15.7倍)，20例中12例样本评估Nlp mRNA水平倍数大于1。此外，Nlp蛋白表达与肿瘤分级有明显地相关性，虽然在晚期HNSCC或者有淋巴转移的HNSCC Nlp表达较高，但是，Nlp蛋白表达与肿瘤分期(P=0.087)或淋巴结分级(P=0.078)没有统计学意义。

3.2 卵巢癌 Qu等[20]将pEGFP-C3-Nlp或者空载体稳定转染到人卵巢癌细胞系SKOV3之后分析细胞增生和凋亡，结果发现Nlp在10个正常卵巢组织中1个阳性(10.0%)，34个良性肿瘤组织中5个阳性(14.7%)，26个交界性肿瘤中9个阳性(34.6%)，131个卵巢癌中73个阳性(55.7%)。免疫反应强度与肿瘤分级明显相关，而与FIGO(国际妇产科协会)分期和组织分型无关。Kaplan-Meier曲线表明Nlp过度表达与总的下降的生存率呈边界性相关。在SKOV3细胞系，Nlp过度表达与抑制紫杉醇诱导的细胞凋亡有关。总之，Nlp在卵巢肿瘤组织中过度表达，Nlp与卵巢癌的发生有关。

3.3 宫颈癌 马莹等[21]采用免疫组化法和逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)法检测并比较28例宫颈癌组织及18例正常宫颈组织中Nlp的表达情况，并分析Nlp表达与宫颈癌临床分期及分化程度的关系。结果发现，42.9%(12/28)的宫颈癌细胞核旁和(或)胞浆部位Nlp呈阳性表达,正常宫颈组织均不表达Nlp，宫颈癌组织中Nlp的阳性表达在不同临床期别和不同分化程度组中无统计学差异(P<0.05)。RT-PCR结果显示Nlp在宫颈癌组织中的表达水平明显高于正常宫颈组织。Nlp表达阳性和表达阴性者中位生存时间分别为34个月和38个月。说明宫颈癌组织中Nlp在蛋白水平、mRNA水平都存在高表达者的预后相对差。

3.4 乳腺癌 Nlp与乳腺癌的关系主要集中在两个方向。(1)BRCA1与Nlp在癌细胞有丝分裂过程中的相互作用：超过70%的遗传性乳腺癌病例表达BRCA1，其为乳腺癌易感基因，与细胞周期的控制相关。目前已证实Nlp是一种BRCA1相互作用蛋白，并且其C端是在Nlp与BRCA1的相互作用中所需要的，这表明Nlp与BRCA1之间的相互作用可能与BRCA1在控制有丝分裂过程中的作用相互桥接。Jin等[22]的研究显示，BRCA1对Nlp在中心体定位很重要。通过siRNA途径或者敲除BRCA1与Nlp连接的区域，Nlp就不能在中心体定位。然而，BRCA1仍能够通过E3的泛素化连接酶活性参与有丝分裂机制。BRCA1与纺锤体极性蛋白形成复合体，因而能确保TPX2(targeting protein for Xklp2)在纺锤体极端的正常浓度以及纺锤体极端正常的组装，BRCA1的此功能是独立于中心体之外的。(2)Nlp过度表达与乳腺癌化疗耐药：Zhao等[23]将Nlp表达载体转染到乳腺癌MCF-7细胞形成稳定克隆。Nlp表达后用MTT和FCM法检测，分析转染的MCF-7细胞的生存率，细胞周期的分配和凋亡。用免疫荧光法探测中心体蛋白和凋亡相关蛋白。随后，检测给予紫杉醇治疗的55例乳腺癌标本的Nlp表达情况。结果表明，过度表达Nlp的MCF-7细胞有更高的生存率。Nlp过度表达会减弱紫杉醇诱导的细胞凋亡，这与Bcl-2的升高一致。Nlp的大量表达会降低微管聚集以及紫杉醇导致β微管蛋白的结构或动力的改变。高表达Nlp的乳腺癌患者可能会抵抗紫杉醇的治疗作用，Nlp阴性患者的应答率为62.5%，Nlp(+)和Nlp(++)分别为58.3%和15.8%(P=0.015)。Nlp表达与plk1和PCNA正相关。

3.5 肺癌 Shao等[10]通过RT-PCR分析技术测定肺癌组织和正常周围组织中(各30例)的Nlp mRNA水平，其中18例肺癌组织中的Nlp mRNA水平高于正常组织2倍。此外，基因的PCR印迹技术分析也表明Nlp基因在人类肺癌组织中扩增。为了进一步证实研究结论，其用FISH来测定肺癌原发灶的拷贝数，Nlp的扩增以一持续增加的数量在基因位点的杂交到Nlp BAC探针，共检测肺癌组织和周围正常组织各15例，结果为6例肿瘤组织有Nlp扩增，但正常组织中均无扩增。

4 展望

综上所述，Nlp 作为新近发现的中心体相关蛋白，与多种人体肿瘤(如乳腺癌、肺癌、宫颈癌、卵巢癌、头颈部鳞状细胞癌等)的发生相关。Nlp与BRCA1的相互作用对于Nlp中心体定位的维持和蛋白稳定性非常重要，并且参与有丝分裂过程。Nlp过度表达对紫杉醇诱导的细胞凋亡抵抗。这些发现为我们的肿瘤学基础研究与临床应用提供了新视角，Nlp可能成为肿瘤早期诊断和药物治疗的重要分子靶点；也为深入了解恶性肿瘤的发生发展机理，寻找早期诊断标志，确定特异性肿瘤药物治疗靶点和制定有效的肿瘤治疗方案提供新思路和理论基础。当然，细胞周期的调控是一系列复杂的过程，也不仅限于现在所发现的分子学机制，相信随着肿瘤分子生物学的发展，会有更多的细胞周期调控蛋白在恶性肿瘤发生发展过程中的分子生物学功能和相关机制被发现。

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