定量检测毒品的蛋白芯片的研发

曾立波，陈连康，胡小龙，陈复华，丁国荣，张玉荣，张润生，梁晨，曹芳琦

（上海市公安局物证鉴定中心，上海市现场物证重点实验室，上海200083）

随着非法制毒、贩毒、吸毒的案件日趋增加，送检的毒品检材在数量和种类上都比以前明显增多。目前在检验鉴定工作中存在以下问题：常规的检验技术是仪器分析，存在以下不足：（1）检测通量低，仪器每次只能对一个样品或一种毒品和毒物成分进行检验鉴定，如果遇到严打专项斗争和发生特发事件，成百上千份样本的测定和几十种毒品需要定性筛查时，此法便显出了其通量小的缺陷；（2）检测速度慢，分析操作周期长和烦琐，一个样品的检测时间约需几小时以上，难以在广大基层单位推广，更不能在现场高通量快速检测。

生物芯片技术是九十年代中期兴起的一种新型生物学技术，它的特点是将生命科学研究中所涉及的样品反应、检测、分析等过程连续化、集成化、微型化。由于其检测信号的高通量、良好的检测灵敏度和数据回收率，生物芯片技术迅速成为目前生命科学研究领域发展最快的技术之一[1]。

蛋白质芯片，又称蛋白质阵列或蛋白质微阵列，基于抗原和抗体专一性结合的原理，将多种蛋白质有序地固定在固相载体（如：特殊处理的玻片、有机膜片、硅微球等）表面形成微阵列，检测生物样品中可与之专一性结合的对应蛋白质[2]。用标记了荧光的蛋白质，经荧光扫描等检测方式测定芯片上各点的荧光强度，来分析蛋白之间或蛋白与其它分子之间的相互作用关系。本项目利用蛋白芯片检测毒品毒物的基础是免疫反应。预先在固相基质上通过化学方法固定载体蛋白偶联的毒品毒物小分子，检测过程中将毒品毒物抗体与待测样品同时加入，样品种的毒品毒物与固定在基质上的小分子完全抗原针对毒品毒物抗体进行竞争免疫反应，没能结合在芯片上的抗体在洗涤步骤中被除去，然后加入荧光标记的二抗进行孵育，最后通过芯片扫描仪获得检测结果[3]。

1 材料与方法

1.1 材料与设备

吗啡和甲基苯丙胺单克隆抗体、吗啡和甲基苯丙胺等毒品与牛血清白蛋白的偶联物（MOR-BSA，METBSA）为本实验室自制；硝酸纤维素膜为Whatman公司产品；吗啡和甲基苯丙胺等毒品标准品为公安部第二研究所提供；高速冷冻离心机为上海飞鸽离心机厂产品；点样系统AD 1500为Bio-dot公司产品；扫描仪InnoScan 710购自INNOPSYS；Cy5荧光标记 （上海开放生物科技有限公司）；小牛血清白蛋白（Sigma公司）；其他试剂均为国产分析纯。

1.2 方法

1.2.1 毒品完全抗原的制备（以吗啡为例）

采用琥珀酸酐法：称取硫酸吗啡20mg，与3倍的琥珀酸酐在苯中回流反应4h，蒸干溶剂，用乙醇洗涤，得到6-琥珀酰吗啡（M-6-S）的固体粉末。6-琥珀酰吗啡与蛋白质的连接采用碳二酸酐法：称取，10mg的BSA（牛血清白蛋白）溶于10mL PBS（磷酸盐缓冲液）中，加入60mg EDC（碳二亚胺）室温下搅拌下反应2～3 h，将反应液10 000 rpm离心除去不溶物，将1.3.1中的6-琥珀酰吗啡（M-6-S）20mg，溶于500uL H2O中，逐滴滴入BSA（牛血清白蛋白）溶液中，室温反应12h。反应产物在4℃，用0.01M，pH 7.4磷酸盐缓冲液透析，期间更换缓冲液3～4次，以除去未反应的小分子物质。最后用紫外光谱法鉴定，即得完全抗原。其它毒品均通过类似方法引入活性基团，再与载体蛋白通过交联剂偶联获得完全抗原。

5mg羊抗鼠IgG多抗溶于2.5ml 0.1M pH8.3的碳酸缓冲液，将Cy5 NHS easter（羟基琥珀酰亚胺酯）溶于DMF浓度为10 mg/ml，加入100 ul的Cy5 NHS easter到抗体溶液中，室温下反应2h，用G25柱除去小分子，标记好的抗体储存于4℃。

1.2.3 毒品蛋白芯片的制备

包括如下步骤：将含有活化基团的硝酸纤维膜芯片片基；置于自动点样仪中，用缓冲液进行梯度稀释的毒品偶联物抗原和质控蛋白进行精确点样，将10nL的毒品偶联物（浓度在300~500ug/mL）地点在固体芯片上进行包被。室温下（25℃）放置3h使之干燥；用含3%BSA 0.5%Tween-20 0.5%PVA（Polyvinyl alcohol）的0.01M pH 7.4的PBS封闭1h；用双蒸水冲洗后在真空干燥箱内干燥，干燥剂、密封4℃保存。形成分离测试区域，而且不会破坏抗体的组成和构造。抗体溶液的分配量由电脑严格控制，保证可以精确的应用到芯片表面。

1.2.4 毒品蛋白芯片的灵敏度及线性的检测

将制备好的芯片用双蒸水清洗，晾干后，将毒品抗体以1：500稀释，加到芯片上，孵育30min，PBS-T洗涤4次，每次10 min，最后用双蒸水冲洗，再加入1：2000 CY5的标记羊抗鼠IgG多抗，孵育30 min，PBS-T洗涤后用ScanArray3000扫描仪扫描，用图像分析软件进行荧光强度分析。计算各每个矩阵的平均荧光强度，所得数据进行线性回归分析。确定线性范围和最低检出浓度。

1.2.5 毒品蛋白芯片的准确性研究

通过对506例样本的检测，同时GC-MS样本中毒品的含量，以每种毒品的阈值为阴性、阳性的判断标准，将毒品芯片检测结果与GC-MS结果比较，得到最终的总符合率，确定毒品蛋白芯片检测的准确性。

1.2.6 毒品蛋白芯片的稳定性研究

在无际的黑夜里，你想过曾经最爱的文字。从前你将它们想象成可以在指尖跃动的音符，每翻开一本书时它们便蹦跳着，奔跑着，在透明的空气里穿针引线，在你的耳朵里缠绕出琴弦，演奏出那一首独属于你的“小确幸”。你提笔创作的时候是你最耀眼的时候，就像阳光在你的身上镀了一层浅浅的金。你认真地谱写曲子，一曲终了，酣畅淋漓。

评估芯片微阵列的稳定性，将毒品检测芯片储存在37℃下28 d，并且信号强度在28 d研究之前和之后各确定一次。

2 结果

2.1 毒品蛋白芯片的标准曲线

竞争测定方法适用于毒品小分子的检测，如果样本中含有毒品，它会与完全抗原竞争抗体结合位点。这将会降低标记的抗体的结合的数量，发光信号会减弱。在竞争反应中，光信号的强弱与样本中出现的毒品的浓度成相反的比例关系。用梯度稀释的毒品标准品制备出芯片的标准曲线，为典型的免疫竞争反应曲线（见图1）。四参数logistic分析的回归方程：Y=（A-D）/[1+（X/C）^B]+D，R2=0.99165其中X代表样本浓度（ng/ml），Y代表化学发光信号强度，A、B、C、D为竞争性测定参数。

图1 用吗啡标准品制备的芯片检测的标准曲线

2.1 与GC/MS结果比较结果

用芯片对多个尿样样本的进行几种常见毒品的定量检测，检测结果与GC-MS检测结果比较，结果显示毒品芯片与GC-MS检测具有较高的相关性，吗啡、甲基苯丙胺、苯丙胺和氯胺酮的相关性分别为：88%，93.2%，94.1%和90.6%（见表1）。

2.2 芯片检测的毒品种类和灵敏度

本项目制备的毒品检测芯片的灵敏度如以图表所示，和目前的胶体金快速检测试剂盒相比较，其尿液中检测所有毒品的灵敏度均提高了10倍以上（见表2）。

2.3 特异性

在芯片的特异性检测试验中，我们选用苯丙胺，甲基苯丙胺。氯胺酮，去甲氯胺酮，吗啡，美沙酮，度冷丁，海洛因，麻黄素，左旋麻黄素，右旋麻黄素，MDMA，可待因，大麻，可卡因，咖啡因，氯丙嗪，布洛芬，蒂巴因，四氢大麻酚，利多卡因，那可丁，阿普唑仑，福尔可啶，喃氟啶，苯噻啶，安定，三唑仑，比沙可啶，苯乙哌啶，硝苯啶，卡马西平，硫唑嘌啶，阿托品，氨苯蝶啶，氟哌啶醇，甲磺酸双麦角毒碱，丁丙诺啡，苯丙醇胺和苯乙胺共40种毒品和药品。作为特异性检测的干扰物质，进行检测，结果显示，本项目制备的毒品检测芯片基本上未发生任何交叉反应。特异性达到99%。

2.4 稳定性

将毒品检测芯片储存在37℃下28d，并且信号强度在28d研究之前和之后各确定一次。结果显示此种芯片可以在下37℃下28d。

3 讨论

膜基片主要适用于制备阵列型的蛋白质芯片，同时也适用于各种多肽、核酸、碳水化合物以及小分子化合物等各类生物信号分子的微阵列制备[4]。化学膜的优点在于不需要做点样前的复杂表面处理，就可以进行点样，但容易造成较高的背景，降低检测的灵敏性[5]。用喷墨打印头将蛋白质样品喷点到固相介质上形成阵列，可以通过电脑程序自动精确控制，效率很高，能够制备较高密度的蛋白质芯片，是今后制作高密度蛋白质芯片的主要方法。膜的参数可调节，如膜厚、生物信号分子的密度、功能基团等。可根据要求选择基片。

制备微阵列的一个共同问题是，每个分离测试区（DTR）分配液滴的干燥期间，会形成“环形污点”或者“圆形图”。干燥期间会集中在液滴周围形成圆环形的非特异性信号[6-7]。这些圆环形的点会在某种程度上影响检测的精确性和重复性。在研制过程中，我们发现点样所用的缓冲液的性质是“环形污点”出现的关键因素，同时，点样缓冲液也是决定DTR形状和稳定性的关键因素。采用添加一定量的蔗糖和海藻糖（6%～20%）不会降低光信号强度，同时对包被的抗原具有极大的稳定作用。

表2 芯片检测常见的毒品种类和灵敏度 单位：（ng/ml）

表1 芯片检测结果与GC-MS结果比较

封闭的目的是消除检测中的非特异结合，提高检测的信噪比。除此之外，封闭还可以有一定稳定作用。本文中制备的芯片采用磷酸盐缓冲液和3%小牛血清白蛋白，加入0.5%的Tween-20和0.5%PVA（Polyvinyl alcohol），具备良好的亲水性，每个分离测试区（DTR）边缘清晰，信号较强并且背景很低。

Cy5是目前常用的蛋白荧光标记物，吸收/发射波长为：650nm/667nm，为红色荧光。具有背景低、灵敏度高的特点。我们采用CY5 NHS ester（羟基琥珀酰亚胺酯），与蛋白交联效率高，操作简单，适合大批量制备。与目前有些蛋白芯片所使用的过氧化物酶的化学发光或显色方法相比，最大的优点是无需顾及酶和底物的活性和污染问题。

毒品芯片的检测具有高通量、灵敏度和自动化程度高的特点，可以根据自身的需求制备不同毒品种类的组合阵列芯片，对于芯片制作过程中每个步骤的精确控制，比如点样过程中的量的控制，封闭过程的控制以及标记效率的控制等，都是解决蛋白芯片批量生产中的批间差和批内差的关键，本文所阐述的研究过程和结果是毒品芯片检测试剂盒的前期数据，要制备出产品化的毒品芯片检测试剂盒，还必须制定一整套生产和质量控制的标准方法，以满足实际应用的需求。

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