雷公藤内酯醇对大鼠胶原性关节炎和免疫功能的影响

李宜川，刘国玲，沈永杰，张玉霞，胡灵卫

(商丘医学高等专科学校生物化学与分子生物学教研室，河南商丘476100)

雷公藤内酯醇对大鼠胶原性关节炎和免疫功能的影响

李宜川，刘国玲，沈永杰，张玉霞，胡灵卫

(商丘医学高等专科学校生物化学与分子生物学教研室，河南商丘476100)

目的研究雷公藤内酯醇(TP)对胶原性关节炎(CIA)的治疗作用。方法制备鸡Ⅱ型胶原诱导的CIA大鼠模型，im给予地塞米松2.0 mg·kg－1或TP 0.1，0.2和0.4 mg·kg－1，每3天1次，连续35 d，正常对照和模型对照组im给予等体积生理盐水。实验过程中观察CIA大鼠的一般情况、足爪肿胀度和关节炎指数的变化。给药结束后第2天，3%巴比妥钠麻醉处死大鼠，取足爪组织制备组织切片观察病理变化;无菌取脾制备脾细胞悬液，用MTT法检测脾T细胞和B细胞增殖反应;制备10%脾组织匀浆，用ELISA法检测脾组织白介素1β(IL-1β)、肿瘤坏死因子α(TNF-α)和IL-6;心脏取血，制备血清用ELISA法测定血清中抗CⅡ抗体水平。结果与正常对照组比较，模型对照组大鼠关节红肿，表面皮肤发亮充血，关节炎指数上升，脾T细胞和B细胞增殖反应、血清中抗CⅡ抗体水平和脾组织中IL-1β，TNF-α和IL-6水平明显升高(P＜0.01)，大鼠足爪皮下组织细胞排列紊乱且有大量炎性细胞浸润及血管增生。im给予TP 0.2和0.4 mg·kg－1可改善CIA大鼠一般状况，明显抑制CIA大鼠足爪肿胀(P＜0.01);降低关节炎指数，在第22，26，30和35天由模型对照组的7.3±0.7，6.3±0.8，4.7±0.7和4.3±0.2分别降低到5.6±0.6，4.9±0.7，3.9±0.5，2.8±0.7和5.1±0.8，4.1±0.4，3.3±0.6，2.7±0.6;抑制脾T和B细胞增殖反应;血清中抗CⅡ抗体水平显著降低，A490nm由模型对照组的0.765±0.018降低到0.583±0.024和0.575±0.034(P＜0.01);脾组织中IL-1β由(159±23)ng·L－1降低到90±15和(79±15)ng·L－1(P＜0.01)，TNF-α由(125±23)ng·L－1降低到94±16和(83±17)ng·L－1(P＜0.01)，IL-6由(250±16)ng·L－1降低到193±18和(180±18)ng·L－1(P＜0.01);能明显改善大鼠足爪组织病理改变，炎性细胞浸润及血管明显减轻(P＜0.05)。TP 0.1 mg·kg－1对上述指标无明显影响。结论TP对Ⅱ型胶原诱导的CIA具有一定的治疗作用。

雷公藤内酯醇;胶原Ⅱ型;关节炎，类风湿;病理学;免疫细胞

类风湿性关节炎(rheumatoid arthritis，RA)是一种慢性、系统性和破坏性的自身免疫性疾病，其主要病理特点是滑膜细胞增生，衬里层增厚，炎性细胞浸润，血管翳形成，继而引起软骨和骨组织的破坏，最终导致关节畸形和功能障碍。常见的临床症状有关节肿胀、疼痛、僵硬、畸形和功能严重受损等。因该疾病早期诊断具有一定的难度而往往耽误了最佳治疗时机。雷公藤内酯醇(triptolide，TP)具有抗炎、抗肿瘤和免疫调节等作用［1］，是现代中西医治疗RA的常用药，但其作用机制尚不十分明确，为进一步研究其治疗RA的作用机制，本研究在成功地制备大鼠胶原性关节炎(collagen-induced arthritis，CIA)模型的基础上，观察TP对CIA大鼠足爪组织的病理学变化和免疫功能的影响，研究其治疗RA作用的可能机制，为临床使用TP治疗RA提供新的实验依据。

1 材料和方法

1.1 动物、药物、主要试剂和仪器

Sprague-Dawley(SD)大鼠60只，雄性，体质量160～180 g，由商丘医学高等专科学校实验动物中心提供，合格证号:2011A02。TP购自南京苏朗生物科技公司，纯度＞90%，实验前将TP用丙二醇50 mol·L－1配制成注射液，其中含TP 100 g·L－1;地塞米松盐酸注射液(5 g·L－1)购自河南确山龙渊药业有限公司。弗氏完全佐剂和鸡Ⅱ型胶原(chicken typeⅡcollagen，CⅡ)上海本草生物医学工程所提供;多聚赖氨酸、刀豆蛋白A(concanavalin A，Con A)、脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)、MTT和DMSO均购自Sigma公司;胎牛血清(fetal bovine serum，FBS)购自Invitrogen公司;IgG抗体测定试剂盒购于PharMingen公司;RPMI 1640培养基Gibco公司产品;小牛血清由杭州四季青生物材料研究所提供;白介素1β(interleukin-1β，IL-1β)、肿瘤坏死因子α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)、IL-6和抗CⅡ抗体检测试剂盒由南京建成生物工程研究所提供。YJ-1450型医学净化工作台购自苏州净化设备公司;Napco-6100型二氧化碳培养箱由美国杜邦公司提供;EL30型酶标仪购于美国Bio-Tek公司。

1.2 动物分组、模型制备和给药

大鼠60只，随机分为正常对照组10只和CIA模型制备组50只。将CⅡ15 mg溶于7.5 ml预先配制好的0.1 mol·L－1的醋酸中，CⅡ浓度为2 g·L－1，共7.5 ml，于4℃过夜充分溶解。次日，于冰浴中与弗氏完全佐剂等体积混合并使之充分乳化，制成稳定的乳化剂15 ml(含CⅡ1 g·L－1，置4℃冰箱保存备用)。在大鼠的左后肢足跖皮内sc给予0.1 ml致炎，第7天在大鼠尾、背多点sc给予0.1 ml该胶原乳剂作为激发注射。正常对照组在同一部位同样方法注射0.1 ml生理盐水。造模后发现45只大鼠左足红肿明显，体积增大，表明造模成功，成功率为90%。将造模成功的45只大鼠随机分为模型对照组、地塞米松治疗组及TP 0.1，0.2和0.4 mg·kg－1治疗组，每组9只。TP组大鼠于造模后第7～35天后腿im给予TP 0.1，0.2和0.4 mg·kg－1，每3 d用药1次;地塞米松治疗组im给予2 mg·kg－1，每天1次;正常对照组和模型对照组后腿im给予0.4 ml·kg－1生理盐水。末次给药后第2天处死大鼠，测定相应指标。

1.3 一般情况观察、足肿胀度和关节炎指数测定

观察各组大鼠饮食、活动状况、皮毛光泽、踝趾关节及体质量变化，用足容积测定仪分别于给药前及给药后不同时间测量各鼠左后足爪体积，给药后不同时间点左后足爪体积与给药前差值表示足爪肿胀度。从致炎后第7天起，每隔4 d采用关节炎评分法(0～4级)，得出关节炎指数(arthritis index，AI)，具体评分标准如下:0分，无红肿;1分，趾关节红肿;2分，趾关节和足趾肿胀;3分，踝关节以下的足爪肿胀;4分，包括踝关节在内的全部足爪肿胀;每肢AI最高分数为4分，四肢AI之和代表每只大鼠的AI，最高值为16分。

1.4 MTT法测定脾T和B淋巴细胞增殖反应［2］

给药结束后第2天，无菌常规制备脾淋巴细胞悬液，锥虫蓝染液进行活细胞计算大于95%，调整细胞浓度至终浓度为1×109L－1;用含体积分数为10%的RPMI 1640培养液培养细胞，按每孔100 μl接种于96孔细胞培养板，给予100 μl Con A(5 mg·L－1)或LPS(5 mg·L－1)分别刺激T和B淋巴细胞，另设不给予Con A和LPS刺激的自身空白对照孔，每个样品每实验点设3复孔。37℃5%CO2培养44 h;每孔加入20 μl MTT(5 g·L－1)，继续培养至48h，终止培养，吸弃培养液，每孔加入200 μl DMSO终止反应，振荡摇匀。用酶标仪检测570 nm吸光度(A)。

1.5 血清抗Ⅱ型胶原抗体测定［3］

给药结束后第2天，心脏取血，室温放置后2236×g离心5 min取血清，进行抗CⅡ特异性抗体检测。用PBS将CⅡ稀释至100 mg·L－1，96孔酶标板每孔加入100 μl稀释后的抗原，密封酶标板。4℃冰箱孵育过夜。洗3遍后，每孔加入200 μl封闭液，室温下封闭1～2 h。清洗后，每孔加入100 μl样品(封闭液稀释)。密封平板，37℃，孵育1 h。用HRP-羊抗大鼠IgG抗体检测血清中抗CⅡ抗体，在室温放置1 h。TMB显色0.5 h后，加入终止液(H2SO41 mol·L－1)。用酶标仪测定A490nm，结果以每组的均值表示。

1.6 脾组织中IL-1β，TNF-α和IL-6含量测定

取300 mg部分脾脏加入冷生理盐水0.9 ml和无水乙醇0.1 ml，制备10%匀浆，4℃，1097×g离心15 min，取上清液，按试剂盒说明检测细胞因子IL-1β，TNF-α和IL-6含量。

1.7 足爪组织病理形态检测

给药结束后第2天，3%巴比妥钠麻醉处死大鼠，取足跖部位组织，用4%甲醛及时固定，石蜡包埋，切片，HE染色，光镜观察足爪组织病理形态学改变。

1.8 统计学分析

2 结果

2.1 雷公藤内酯醇对CIA大鼠一般情况和足爪肿胀的影响

如表1结果所示，病变过程中，CIA模型大鼠进食量减少，体质量增长缓慢，甚至下降，皮毛失去光泽，并伴有轻微脱毛。大鼠致炎数小时后，可见部分大鼠出现关节红肿;第7天激发注射后，踝趾关节炎症状逐渐加重，关节红肿且表面皮肤发亮充血，足垫增厚;到第35天部分大鼠活动量减少，出现负重困难。与模型对照组相比，地塞米松2 mg·kg－1和TP各剂量组至造模后第14天足爪肿胀无明显改善，从第18天开始至第35天TP 0.2和0.4 mg·kg－1及地塞米松2 mg·kg－1组可见关节红肿逐渐减轻，发亮充血皮肤出现轻微皱缩，趾尖出血点颜色变浅变淡，足爪肿胀度明显减轻(P＜0.01)，表明TP可明显抑制CIA大鼠足爪肿胀。

Tab.1 Effect of triptolide(TP)on paw swelling degree of chicken typeⅡcollagen(CⅡ)-induced arthritis(CIA)model rats

2.2 雷公藤内酯醇对CIA大鼠多发性关节炎的影响

如表2所示，与正常对照组相比，致炎后第l4天开始模型对照组大鼠AI明显升高(P＜0.01);TP 0.2和0.4 mg·kg－1组及地塞米松2 mg·kg－1组22 d后，大鼠关节炎症状明显减轻，足肿胀明显减退，大鼠行动灵活，与模型对照组比较AI降低(P＜0.01)。TP 0.1 mg·kg－1组无明显变化。

2.3 雷公藤内酯醇对CIA大鼠脾T和B淋巴细胞增殖反应及血清抗CⅡ抗体水平的影响

如表3所示，与正常对照组相比，模型对照组大鼠Con A诱导的脾T淋巴细胞增殖活性和LPS诱导的脾B淋巴细胞增殖活性均明显升高(P＜0.01)，血清中抗CⅡ抗体水平显著增高(P＜0.01);与模型组比较，TP 0.2和0.4 mg·kg－1组可抑制Con A诱导的T淋巴细胞增殖反应和LPS诱导的B淋巴细胞增殖反应(P＜0.01)，血清抗CⅡ抗体水平降低(P＜0.01);TP 0.1 mg·kg－1对上述指标无明显影响。

Tab.2 Effect of TP on arthritis index(AI)of CⅡ-induced arthritis model rats

Tab.3 Effect of triptolide on spleen T and B lymphocyte proliferation and serum anti-CⅡantibody of CⅡ-induced arthritis model rats

2.4 雷公藤内酯醇对CIA大鼠脾细胞因子IL-1β，TNF-α和IL-6含量的影响

如表4所示，与正常对照组相比，模型对照组大鼠脾细胞因子IL-1β，TNF-α和IL-6含量显著升高(P＜0.01);与模型对照组相比，TP 0.2和0.4 mg·kg－1组与地塞米松2 mg·kg－1组各项指标均显著下降(P＜0.01)，TP 0.1 mg·kg－1组无明显变化(P＞0.05)。

Tab.4 Effect of triptolide on levels of interleukin-1β(IL-1β)，tumor necrosis factor-α(TNF-α)and IL-6 in spleen tissue of CⅡ-induced arthritis model rats

2.5 TP 对CIA鼠足爪组织病理改变的影响

病理形态学观察结果(图1)显示，正常大鼠皮下组织细胞排列规则、紧密，无血管新生及炎性细胞浸润;模型组大鼠皮下组织细胞排列不规则，炎性细胞浸润严重，有明显的血管增生现象。TP 0.2和0.4 mg·kg－1与地塞米松能明显改变CIA大鼠关节炎皮下组织细胞排列、炎性细胞浸润及血管增生现象，TP 0.1 mg·kg－1对改善CIA大鼠足部皮肤的病理状况无明显作用。

3 讨论

雷公藤为卫矛科植物，始载于《本草纲目拾遗》，药用部分为去皮的根及根茎，中医认为其味辛苦性凉，归肝肾经，有祛风除湿、活血通络、消肿止痛和清热解毒等功效［4］。雷公藤内酯醇是雷公藤主要成分之一，具有明显的抗炎、抗风湿和免疫抑制作用［5］。

Fig.1 Effect of triptolide on paw skin pathological changes of CⅡ-induced arthritis model rats(HE×400).See Tab.1 for rat treatments.The rats were sacrificed at the 35th day，and the pathological changes of the rat paw were observed by light microscopy.A:normal;B:model，the subcutaneous tissue cells arranged derangement，inflammatory cells infiltrated and vascular proliferated;C:dexamethasone 2.0 mg·kg－1，dexamethasone could significantly improve the foot skin pathological changing;D:TP 0.1 mg·kg－1，no significant improvement in foot skin pathological changing;E and F:TP 0.2 and 0.4 mg·kg－1，the foot skin pathological changing was significantly improved.

CIA大鼠模型与佐剂性关节炎(adjuvant arthritis，AA)模型相比，CIA模型的免疫功能变化不仅表现在细胞免疫，而且表现在体液免疫，由于这些特征更接近于临床RA，因此CIA模型是筛选和研究治疗RA药物的理想模型［6］。本研究发现，与模型对照组比较，TP 0.2和0.4 mg·kg－1可明显改善CIA大鼠一般情况，降低AI，使关节炎症状明显减轻，有效缓解体质量下降，可见TP对CIA关节炎大鼠具有明显的治疗作用。

关于RA的病因和病理机制目前还不十分明确，但越来越多的研究表明，RA是一种典型的多因素诱发的自身免疫反应性疾病，活化的T淋巴细胞在发病中起重要作用［7－8］。据报道，CIA大鼠淋巴细胞免疫功能紊乱，Th1/Th2比例失调，在抗原特异性T细胞的辅助下，刺激B细胞产生抗体［9］。B淋巴细胞的主要功能是接受外来抗原刺激、增殖、发育为分泌抗体的浆细胞，并继而产生抗体，是体液免疫的基础。本研究结果表明，TP 0.2和0.4 mg·kg－1除可抑制CIA大鼠Con A诱导的T淋巴细胞增殖活性，还可降低LPS诱导的CIA大鼠B淋巴细胞增殖反应，提示T细胞和B细胞共同参与了CIA的发病过程。另外，TP 0.2和0.4 mg·kg－1还能降低CIA大鼠血清抗CⅡ抗体水平，与文献［8］报道相似，TP不仅可以通过抑制细胞免疫而且也可通过抑制体液免疫发挥其对CIA的治疗作用。

IL-1β，TNF-α和IL-6是主要炎性细胞因子，在RA或实验性关节炎滑膜病变中起着重要的致病作用。TNF-α为居中心地位的促炎性细胞因子，它不仅具有诱导炎症、酶的释放、纤维细胞增生及组织损伤［9］，而且还是破骨细胞的活化因子，能引起骨和软骨的吸收破坏，促进成纤维细胞增生［11］。IL-6的作用主要在于诱导免疫球蛋白的产生及急性期蛋白的形成，除了对B细胞的效应外，IL-6还参与T淋巴细胞的分化和活化，诱导T效应细胞引起组织损伤;另外IL-6还能增强IL-1和TNF-α的效应。IL-1β可诱导RA关节滑膜细胞增殖，刺激滑膜细胞产生蛋白激酶，增强TNF-α和IL-6的效应。IL-1β，TNF-α和IL-6的高水平分泌在免疫和炎症反应中有复杂的放大效应，可导致细胞毒作用，介导免疫损伤。据报道，TP可降低CIA大鼠外周血清和关节腔中细胞因子水平，从而发挥对关节炎的治疗作用［12］。本研究结果表明，TP 0.2和0.4 mg·kg－1能明显抑制脾脏中IL-1β，TNF-α和IL-6等细胞因子的产生，提示TP对CIA的治疗还与其改善异常的细胞免疫功能有关。

综上所述，抗体与免疫细胞分泌的大量细胞因子共同参与了CIA大鼠的发病过程，是引起关节慢性炎症和其他症状的重要因素。TP可明显改变大鼠关节组织病理变化，降低AI，缓解相关症状，其机制可能与其抑制增高的T和B淋巴细胞增殖反应、调节CIA大鼠的免疫功能、使体内炎性细胞因子分泌下降、从而对CIA大鼠产生特异性的免疫治疗作用有关。

［1］Shi LP，Yang DQ，Zhou XG，Liu ZH.Effect of Tripterygium wilforldi Hook.on activity of proliferation and secretion of IL-6 and TNF-α in peripheral blood mononuclear cells in patients with rheumatoid arthritis［J］.Pract Prev Med(实用预防医学)，2008，15(3):677-678.

［2］Chen Q，Wei W.Effects and mechanisms of glucosides of Chaenomeles speciosa on collagen-induced arthritis in rats［J］.Int Immunopharmacol，2003，3(4):593-608.

［3］Jin Y，Li J，Zhang YF，Li CY，Xu SY.The therapeutic action of actarit in typeⅡcollagen-induced arthritis mice and its mechanism［J］.Chin Pharm J(中国药学杂志)，2001，36(12):814-817.

［4］Zhang QD，Shi YB，Tab WF，Wang F.Effect of triptolide on the changes of VEGF and MMP-9 levels in the rheumatoid arthritisfibroblast-likesynoviocyteline，MH7A［J］.Acta Univ Med Nanjing(Nat Sci)〔南京医科大学学报(自然科学版)〕，2008，28(7):902-905.

［5］Mao XD，Sun SJ，Pei ZY，Zhang LH.Inhibitory effect of triptolide on interleukin-18 and its receptor in rheumatoid arthritis synovial fibroblosts［J］.Chin J Cell Mol Immunol，2009，25(7):606-611.

［6］Zhu L，Wei W.Effects of total glucosides of paeony on immune functions in rats with collagen-induced arthritis［J］.Chin Pharm J(中国药学杂志)，2007，42(20):1547-1551.

［7］Yocum DE.Tcells:pathogenic cells and therapeutic targets in rheumatoid arthritis［J］.Semin Arthritis Rheum，1999，29(1):27-35.

［8］Liu CF，Lin N，Jia HW，Xiao C，Zhang LS.Effect of triptolide on immunological function of mice with collagenⅡ-induced arthritis［J］.Chin J Inf TCM(中国中医药信息杂志)，2004，11(7):602-604.

［9］Chen Y，Wei W，Wu H，Tang LQ，Wang XY，Yang YQ.Down-regulation effect of glucosides of Cheanomeles speciosa on the levels of serum antibodies in rats with adjuvant arthritis［J］.Chin Pharmacol Bull(中国药理学通报)，2007，23(7):941-944.

［10］Dayer JM，Beutler B，Cerami A.Cachectin/tumor necrosis factor stimulates collagenase and prostaglandin E2production by human synovial cells and dermal fibroblasts［J］.J Exp Med，1985，162(6):2163-2168.

［11］Peacock DJ，Banquerigo ML，Brahn E.Angiogenesis inhibition suppresses collagen arthritis［J］.J Exp Med，1992，175(4):1135-1138.

［12］Tu SH，Sheng DY，Hu YH，Zeng KQ.Interventional effects of triptolide on the levels of cytokines in peripheral serum and articular cavity of rats with collagen induced arthritis［J］.Chin J Clin Rehabilit(中国临床康复)，2006，10(39):183-185.

Effect of triptolide on collagen-induced arthritis and immune function in rats

LI Yi-chuan，LIU Guo-ling，SHEN Yong-jie，ZHANG Yu-xia，HU Ling-wei
(Department of Biochemistry and Molecular Biology，Shangqiu Medical College，Shangqiu476100，China)

OBJECTIVETo investigate the effect of triptolide(TP)on collagen-induced arthritis(CIA).METHODSChicken typeⅡcollagen(CⅡ)was used to induce the CIA model.Dexamethasone 2.0 mg·kg－1or TP 0.1，0.2 and 0.4 mg·kg－1was im given to rats，once for 3 d，until 35 d.The change of the rats，the paw swelling degree and the articular index(AI)were observed.On the 3 5th day，the rats were sacrificed and the histopathological changes in paw tissues were observed by HE staining.The proliferation of spleen T and B lymphocytes was detected by MTT assay.The level of interleukin-1β(IL-1β)，TNF-α and IL-6 in spleen tissue homogenate and anti-CⅡIgG antibody in serum was examined by ELISA.RESULTSCompared with normal control group，the joint of rats in model group showed swelling，the surface of skin shined and congested，and AI rose.The proliferation of spleen T and B lymphocytes，the level of anti-CⅡIgG antibody in serum and the content of IL-1β，TNF-α and IL-6 in the spleen all significantly increased(P＜0.01).The subcutaneous tissue cells of the rat paw became deranged，inflammatory cells infiltrated and blood vessels proliferated.TP 0.2 and 0.4 mg·kg－1was able to improve the general situation of CIA rats，significantly inhibit the paw swelling degree and reduce AI.AI on the 22nd，26th，30th and 35th day was reduced from 7.3±0.7，6.3±0.8，4.7±0.7 and 4.3±0.2 in model group to 5.6±0.6，4.9±0.7，3.9±0.5 and 2.8±0.7 for TP 0.2 mg·kg－1，and 5.1±0.8，4.1±0.4，3.3±0.6 and 2.7±0.6 for TP 0.4 mg·kg－1(P＜0.01).The proliferation of spleen T and B lymphocytes was also suppressed.In TP 0.2 and 0.4 mg·kg－1groups，the level of anti-CⅡIgG antibody in serum(A490nm)was reduced from 0.765±0.018 in model group to 0.583±0.024 and 0.575±0.034(P＜0.01)，IL-1β content in spleen tissue was reduced from(159±23)ng·L－1to 90±15 and(79±15)ng·L－1，TNF-α from(125±23)ng·L－1to 94±16 and(83±17)ng·L－1，and IL-6 from(250±16)ng·L－1to 193±18 and(180±18)ng·L－1(P＜0.01).TP 0.2 and 0.4 mg·kg－1could reduce the inflammatory cell infiltration and angiogenesis of rat paws.TP 0.1 mg·kg－1had no significant effect on the above indicators.CONCLUSIONTP can improve the immune function of CIA model rats.TP has therapeutic effect on CIA.

triptolide;collagen typeⅡ;arthritis，rheumatoid;pathology;immunocyte

The project supported by Science and Tehnology Development Project of Shangqiu City of Henan Province in 2011(20115004)

LI Yi-chuan，Tel:(0370)3263366，E-mail:yichuan_Li@126.com

R285.5

A

1000-3002(2012)04-0540-06

10.3867/j.issn.1000-3002.2012.04.013

河南省商丘市2011年科技发展计划项目(20115004)

李宜川(1960－)，女，副教授，主要从事生物化学与分子生物学研究。

李宜川，E-mail:yichuan_Li@126.com，Tel:(0370)3263366

2012-03-23接受日期:2012-06-12)

(本文编辑:齐春会)