男性不育患者精液活性氧和精浆超氧化物岐化酶活性测定的临床价值研究

谭雪莲，黄永汉，李颖嫦，李子萍，姜朝新，游永强，庄锡伟，龚道元

(1、佛山市南海区第三人民医院，广东 佛山 528244；2、佛山市第一人民医院；3、佛山科学技术学院医学院；4、佛山官窑南海经济开发区人民医院官窑分院；5、佛山市禅城区中心医院)

男性不育患者精液活性氧和精浆超氧化物岐化酶活性测定的临床价值研究

谭雪莲1，黄永汉2，李颖嫦2，李子萍3，姜朝新1，游永强4，庄锡伟5，龚道元3

(1、佛山市南海区第三人民医院，广东 佛山 528244；2、佛山市第一人民医院；3、佛山科学技术学院医学院；4、佛山官窑南海经济开发区人民医院官窑分院；5、佛山市禅城区中心医院)

目的探讨精液ROS、精浆SOD测定在男性不育患者中临床价值。方法选择有生育力的男性健康对照组50例，男性不育症组265例，化学发光法测定精液ROS，黄嘌呤氧化酶法测定精浆SOD活性。结果男性不育组、精索静脉曲张组和白细胞精子症组：精液ROS均明显高于对照组精液ROS，精浆SOD均明显低于对照组精浆SOD，以上组间结果差异都具有统计学意义(P＜0.01)。各弱精子症组：精液ROS均明显高于对照组(P＜0.01)，精浆SOD均明显低于对照组(P＜0.01)。各弱精子症组随着精子活力降低：精液ROS依次升高(组间结果差异有显著性意义，P＜0.01)；精浆SOD依次降低，其中中度弱精子症组精浆SOD与轻度弱精子症组相比较，结果无统计学意义(P＞0.05)，重度弱精子症组精浆SOD明显低于中度弱精子症组和轻度弱精子症组，组间结果差异有统计学意义(P＜0.01)。结论ROS是影响男性不育的一个重要病因和病理因素，男性不育患者精液ROS和精浆SOD检测具有重要的临床意义。

男性不育；精液；活性氧；超氧化物岐化酶

氧化应激过程中产生的活性氧 (reactive oxygen species,ROS)在生殖及发育中的损伤作用越来越受到关注，ROS也称氧自由基,是一些具有比氧更活跃的化学反应性的氧代谢产物及其衍生的含氧物质[1]，研究发现精液高水平ROS是导致男性不育的重要原因[2]。超氧化物岐化酶(superoxide dismutase,SOD)是机体内起主要作用的酶类抗氧化剂，具有清除ROS等氧自由基，保护细胞膜免受损伤，抵抗ROS对精子的毒性作用[3]。本研究通过测定男性不育患者精液中的ROS和精浆中SOD水平，探讨ROS和SOD在男性不育症中的作用及它们间相互关系，从多角度为临床对男性不育的诊断提供分子水平的实验证据。

1 材料与方法

1.1 实验对象与分组

1.1.1 实验对象 男性不育症组均来自佛山市禅城区中心医院男性科不育门诊就诊的男性不育症患者，年龄 22～36 岁，平均(27.0±4.5)岁，婚后性生活正常，未避孕2年以上不育，无外伤及遗传性疾病家族史，无性功能障碍病史，体检未发现有明显睾丸、附睾及输精管异常，女方生育能力经检验排除异常。健康对照组来自有子女的自愿献精者，年龄24～38 岁，平均 (27.5±4.7)岁。

1.1.2 实验分组 ①健康对照组50例：精子密度≥20×109/L，精子活率＞60%,a 级精子＞25%或(a+b)级精子＞50%，精子正常形态率大于30%，有生育史；②参数正常男性不育组21例：指精子密度、活率、活力、形态等常规参数指标全部正常；③参数异常男性不育组79例：主要指精子密度、活率、活力、形态等常规参数指标中一个或几个不正常；④精索静脉曲张组25例：B超明确诊断为一侧VC；⑤白细胞精子症组52例：精液中白细胞﹥1.0×106/ml；⑥轻度弱精子症组 27例：30%≤(a＋b)级精子＜50%；⑦中度弱精子组42例：10%≤(a＋b)级精子＜30%；⑧重度弱精子症组19例：(a＋b)级精子＜10%。

1.2 主要仪器与试剂

1.2.1 仪器 WLJY-9000型伟力彩色精子质量分析系统(南昌新长征医疗科技发展有限公司)。

1.2.2 试剂 鲁米诺和VI型辣根过氧化物酶均购自为Sigma；SOD测定试剂盒购自南京建成生物工程研究所。

1.3 方法

1.3.1 精液标本采集与处理 ①精液标本采集：所选受试者禁欲2～7d，于医院处置室内手淫取精，置干燥无菌量杯内，37℃水浴箱内液化，并记录液化时间。②精浆标本制备：精液以3000 r/min离心15 min,取上层精浆于-40℃保存待测。

1.3.2 精子密度、活率、活力等指标测定 采用国产WLJY-9000型伟力彩色精子质量分析系统测定精子密度、活率、活力等指标。

1.3.3 精子形态检查 精液涂片用改良巴氏染色，根据WHO手册进行检查。

1.3.4 精液ROS测定 参考“赵洪鑫等介绍测定方法[4]。用化学发光法检测精液ROS水平，将400μl完全液化后的精液加入一次性照度计容器内，取4μl鲁米诺储存液，同时加入8μl辣根过氧化物酶(12.4 U的Ⅵ型辣根过氧化物酶,310U/mg)。 使用Berthold照度计检测化学发光信号约5 min,直至其达到稳定。为了平衡精子密度对各组ROS水平带来的混杂作用,按照下式计算调整各组ROS水平:平衡精子密度后的ROS水平=相对化学发光强度(RLU/s)×20 ×106/精子密度(精子数/ml)×0.4ml，计算后的ROS单位为RLU/s每20×106精子。

1.3.5 精浆SOD测定 按说明书操作。

1.3.6 统计学分析 采用SPSS 10.0软件包，检测数据以±s表示，均值比较采用t检验，P＜0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 男性不育组与健康对照组精液ROS、精浆SOD结果比较 表1结果显示，参数正常和参数异常男性不育组精液ROS均明显高于健康对照组，结果差异有显著统计学意义(P＜0.01)，参数异常男性不育组精液ROS高明显于参数正常男性不育组，结果差异有显著统计学意义(P＜0.01)；参数正常和参数异常男性不育组精浆SOD明显低于健康对照组，结果差异有显著统计学意义(P＜0.01)，参数异常男性不育组精浆SOD低于参数正常男性不育组，结果差异无统计学意义(P﹥0.05)。

2.2 精索静脉曲张组、白细胞精子症组与健康对照组精液ROS、精浆SOD结果比较 表2结果显示，两组精液ROS明显高于健康对照组(P＜0.01)；白细胞精子症组精液ROS明显高于精索静脉曲张组(P＜0.01)。两组精浆SOD明显低于健康对照组(P＜0.01)；白细胞精子症组精浆SOD明显低于精索静脉曲张组(P＜0.01)。

2.3 各弱精子症组和健康对照组精液ROS、精浆SOD结果比较 表3结果显示，各弱精子症组精液ROS均明显高于健康对照组(P＜0.01)；弱精子症各组精浆SOD均明显低于健康对照组(P＜0.01)。各弱精子症组随着精子活力降低，精液ROS依次升高，组间结果差异有显著性意义(P＜0.01)；弱精子症各组随着精子活力降低，精浆SOD依次降低，其中中度弱精子症组精浆SOD与轻度弱精子症组相比较，结果无统计学意义(P＞0.05)，重度弱精子症组精浆SOD明显低于中度弱精子症组和轻度弱精子症组，组间结果差异有显著性意义(P＜0.01)。

3 讨论

表1 男性不育组与健康对照组ROS、SOD结果比较(±s)

表1 男性不育组与健康对照组ROS、SOD结果比较(±s)

注:★与健康对照组比较，P＜0.01；▲与参数正常男性不育组比较，P＜0.01；▼与参数正常男性不育组比较，P＞0.05。

患者组别 例数 精液ROS(RLU/s) 精浆SOD(nU/ml)健康对照组参数正常男性不育组参数异常男性不育组50 21 79 17.6±2.84 39.28±3.57★79.77±4.32★▲56.40±10.12 31.07±9.91★24.72±8.75★▼

表2 精索静脉曲张组、白细胞精子症组与健康对照组ROS、SOD结果比较(±s)

表2 精索静脉曲张组、白细胞精子症组与健康对照组ROS、SOD结果比较(±s)

注:★与健康对照组比较，P＜0.01；▲与精索静脉曲张组比较，P＜0.01。

患者组别 例数 精液ROS(RLU/s) 精浆SOD(nU/ml)健康对照组精索静脉曲张组白细胞精子症组50 25 52 17.16±2.84 235.34±5.14★813.52±10.64★▲56.40±10.12 31.23±8.13★19.85±7.75★▲

表3 弱精子症各组和健康对照组ROS、SOD结果比较(±s)

表3 弱精子症各组和健康对照组ROS、SOD结果比较(±s)

注：★与健康对照组比较，P＜0.01；▲与轻度弱精子症组比较，P＜0.01，●与轻度弱精子症组比较，P＞0.05；▼与中度弱精子症组比较，P＜0.01。

患者组别 例数 精液ROS(RLU/s) 精浆SOD(nU/ml)健康对照组轻度弱精子症组中度弱精子症组重度弱精子症组50 27 42 19 17.16±2.84 35.21±3.93★67.77±5.61★▲98.43±6.63★▲▼56.40±10.12 34.34±9.65★27.889±8.49★●14.49±7.65★▲▼

机体内存在抗氧化防御系统，SOD在男性生殖系统中是起主要抗氧化作用的酶类抗氧化剂[5]，具有清除ROS和中和ROS对精子的潜在毒性作用，使ROS产生和清除保持动态平衡，这种平衡是保持正常生育能力的基础。当机体ROS产生增加或SOD含量降低则打破这种平衡，产生精子氧化应激损伤，可以导致男性不育[6]。本研究结果显示,男性不育组精液ROS活性明显高于健康对照组，精浆SOD活性明显低于健康对照组，提示精液ROS活性和精浆SOD活性测定对男性不育的诊断具有重要临床价值，另外，本研究还发现参数异常男性不育组精液ROS活性明显高于参数正常男性不育组，而参数正常男性不育组精浆SOD低于于参数正常男性不育组，但结果无统计学意义，这具有重要意义，说明ROS除影响常规精液参数外，还可通过其他机制导致男性不育，ROS有可能作为一个独立的指标指导男性不育的诊断，同时提示精液ROS活性测定比精浆SOD测定更有价值，更加准确反映精子氧化应急状态。

Ozdamar等研究发现[7]，精索静脉曲张时睾丸局部缺氧、代谢性酸中毒、无氧酵解增强，ATP被分解为次黄嘌呤，并在黄嘌呤氧化酶作用下产生大量的ROS，而大量ROS也会消耗过多的ROS，本研究结果证实如此。因此，ROS过多和/或者SOD过低，可导致氧化应激，氧化应激可能是引起精索静脉曲张患者不育的一个重要因素[8]。研究证明，精液中的白细胞含量增加是导致ROS增高的重要原因之一[9]，本研究中白细胞精子症组精液中ROS水平明显高于健康对照组和静脉曲张组，精浆中SOD水平明显低于健康对照组和静脉曲张组，推测一方面是由于白细胞本身大量产生ROS，另一方面则与白细胞抑制ROS清除酶如SOD、谷光甘肽等有关。

在男性生殖道中,适量低浓度的ROS对精子有着重要的生理作用，如精子的高活跃性运动、获能及完成顶体反应等，但是过多ROS或SOD下降可引起氧化应急，导致精子运动能力下降甚至丧失，本研究结果也证实了这点，各弱精子症组精液中ROS的水平明显高于健康对照组，精浆中SOD的水平明显低于健康对照组，随着精子活动力下降，精液中ROS的水平也依次升高，精浆中SOD的水平也依次降低，最终结果导致ROS含量过多，产生氧化应激，使精子活动力下降。 ROS过多导致精子运动力下降的机制主要有：(1)过多的ROS引起精子细胞膜脂质的过氧化及链式反应[10]，产生过多MAD，造成精子膜硬度增加，膜流动性减弱，使精子膜的超微结构损伤，精子运动能力下降甚至丧失；(2)精子线粒体是提供精子运动的源泉，过多的ROS也会导致精子线粒体的超微结构损伤，影响到精子运动能力；(3)ROS也会引起ATP耗竭，从而导致精子精子活动力丧失。

ROS是影响男性不育的一个重要病因和病理因素，男性生殖系统中产生的ROS和抗氧化剂(主要是SOD)动态平衡是保持正常生育能力的基础，对男性不育患者精液ROS和精浆SOD进行检测具有重要的临床意义。

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[4]赵洪鑫，史庭燕，时伟丽,等.应用化学发光法检测男性不育人群精液活性氧水平[J].中华男科学杂志，2009，23(4)：14-17.

[5]李忠培，邓 文，于爱莲,等.男性不育患者精浆活性氧与细胞因子的相关性研究[J].中国病原生物学杂志，2011，6(7)：486-489.

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[7]Ozdamar AS,Soylu AG,Gulha M,et al.Testicular oxidative stress.Effects of experimental varicocele in adolescent rats[J].Urol Int,2004,73(4):343-347.

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Clinical significance of semen reactive oxygen species and seminal plasma superoxide dismutase activity detection in infertile patients.

TAN Xuelian,HUANG Yonghan,LI Yingchang,et al.Third People's Hospital of Foshan City Nanhai District，Guangdong Foshan 528244,China

ObjectiveTo investigate the clinical significance of semen ROS and seminal plasma SOD activity in male infertility.MethodsSemen ROS and seminal plasma SOD of 50 cases from fertile male as the healthy control group and 265 patients with male infertility as the test group were detected by chemiluminescence method and xanthine oxidase method respectively.ResultsThe levels of semen ROS and seminal plasma SOD in male infertility group，varicocele group and leukocytospermia group were significantly different from that of the healthy control group(P<0.01).The levels of semen ROS in each asthenospermia group were significantly higher than that of the healthy control group(P<0.01)and the levels of seminal plasma SOD in each asthenospermia group were significantly lower than the control group(P<0.01).The levels of semen ROS in each asthenospermia group increased(P<0.01)and the level of seminal plasma SOD decrease with the decreased sperm motility.There was no statistical significance(P>0.05)between the levels of seminal plasma SOD in moderate asthenospermia group and slight asthenospermia group.The levels of seminal plasma SOD in severe asthenospermia group was significantly lower than that of moderate asthenospermia group and mild asthenospermia group(P<0.01).ConclusionROS is an important etiological and pathological factor in male infertility.The levels of sperm ROS and seminal plasma SOD have important clinical significance.

Male infertility； Semen； Reactive oxygen species； Superoxide

R446.19，R698+.2

A

1674-1129(2012)05-0422-04

10.3969/j.issn.1674-1129.2012.05.002

广东省自然科学基金课题(No.9152902001000017)

谭雪莲，女，1971年3月出生，毕业于佛山科学技术学院医学院，主管检验技师，医学检验专业，

龚道元，男，1964年7月1日出生，副教授。