竹叶黄酮和竹叶多糖清除亚硝酸盐的作用

（武夷学院 生态与资源工程系——福建省高校绿色化工技术重点实验室，福建 武夷山354300）

竹叶在我国有着悠久的食用和药用历史，其性淡、微涩、寒、味甘，具有清热利尿、明目解毒、止血、免疫调节、抗氧化、抗艾滋病和抑制肿瘤等功效，且无毒无害，可作为绿色食品进行开发。竹叶黄酮和多糖在竹叶中的含量丰富，具有多种药理和保健作用[1-4]。目前对竹叶的研究主要集中在竹叶提取物、竹叶黄酮、竹叶多糖抗氧化、清除自由基方面，而对于竹叶黄酮和多糖清除亚硝酸盐的作用报道很少。闽北是中国竹子之乡，但目前对竹叶的利用十分有限，大部分被废弃物处理，未能得到充分的利用。本试验从竹叶中提取黄酮和多糖，测定了它们清除亚硝酸盐的作用，并同Vc进行比较，结果如下。

1 材料与方法

1.1 仪器：MAPADA分光光度计、索氏脂肪提取器、旋转搅拌仪、超声洗涤器、旋转蒸发仪、湘仪H-2050R高速离心机等。

1.2 试剂：石油醚（沸程 30～60℃）、无水乙醇、盐酸、冰乙酸、氢氧化钠、芦丁、硝酸铝，葡萄糖、3，5-二硝基水杨酸试剂、亚硝酸钠、氯化铵、无水对氨基苯磺酸、盐酸萘乙二胺、以上试剂均为AR，试验用水均为二次蒸馏水。

1.3 芦丁标准曲线的绘制：

取25 mL刻度试管支，按下表加试剂：

芦丁标准液（0.2mg/mL）(mL) 0 1.0 2.0 3.0 4.0 5.0 6.0 5%亚硝酸钠(mL) 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 10%硝酸铝(mL) 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 4%氢氧化钠(mL) 10.0 10.0 10.010.0 10.0 10.0 10.0

蒸馏水加至25mL摇匀，放置6分钟，以1cm比色皿、1号管调零、500nm测吸光度，绘制标准曲线。

1.4 葡萄糖标准曲线绘制：取25刻度试管7支，按下表加液：

葡萄糖标准液（1mg/mL） 0 0.5 1.0 1.5 2.0 3.0 4.0重蒸水（mL） 4.0 3.5 3.0 2.5 2.0 1.0 0 3,5-二硝基水杨酸试剂（mL） 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0

混匀，在沸水中加热5分钟，取出，立即用冷水冷却至室温，再向每管加重蒸水20mL混匀，用1号管调零，520nm测吸光度，绘制标准曲线。

1.5 亚硝酸盐标准曲线绘制：在25ml具塞比色管按下表加液：

亚硝酸钠标准应用液（10.0μg/mL）（mL） 0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5相当于亚硝酸钠（μg） 0 5.0 10.0 15.0 20.0 25.0氯化铵缓冲液（mL） 4.5 4.5 4.5 4.5 4.5 4.5 60% 乙酸（mL） 2.5 2.5 2.5 2.5 2.5 2.5 0.4%对氨基苯磺酸(mL） 2.0 2.0 2.0 2.0 2.0 2.0混匀，静置 3～5min 0.1%盐酸萘乙二胺（mL） 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0

重蒸水加至25mL，混匀，静置5min，用1cm比色杯、1号管调零，538nm测定吸光度，绘制标准曲线。

1.6 竹叶黄酮和多糖的提取：竹叶采自武夷学院内，先用蒸馏水洗涤、80℃烘干、粉碎、过40目筛。将竹叶粉末置于索氏脂肪提取器，用石油醚回流去除脂肪、色素后用 80%乙醇为溶剂、固液比 1∶10、60℃搅拌45min，再以30℃超声辅助5min的条件提取黄酮，提取液用旋转蒸发仪浓缩至适量后以芦丁为标准测定黄酮含量，直接用于实验。将提取黄酮后的竹叶残渣烘干，用10倍体积的蒸馏水、80℃、搅拌45min，再以30℃、250W超声辅助5min的条件提取多糖，提取液用旋转蒸发仪减压浓缩至适量后以10%的三氯乙酸调pH至3.0沉淀蛋白质，离心除蛋白后的多糖浓缩液80℃左右烘干水份得竹叶多糖粗品。精确称取烘干的竹叶多糖粗品100mg，用蒸馏水溶解定容至100mL，过滤后用3，5-二硝基水杨酸法测定还原糖、总糖，计算多糖的含量和纯度。

1.7 清除亚硝酸盐的测定方法：在标准管中加入20μg的亚硝酸钠标准液；在样品空白管和样品测定管中分别加入0.10～5.00（mL）1mg/mL浓度的竹叶黄酮、竹叶多糖、Vc，样品测定各平行3管，各管再加入20μg的亚硝酸盐标准液，混匀，静置反应5min后同标准曲线测定加入其余试剂后比色。样品对亚硝酸盐的清除率 （%）=[标准管吸光度－（样品测定管吸光度－样品空白管吸光度）]÷标准管的吸光度×100

1.8 数据统计处理：标准曲线计算回归方程和相关系数；测定结果列出n，X±S，组间差异以t检验或方差分析，SSR法多重比较。

2 结果

2.1 竹叶黄酮的提取率为0.83%，竹叶多糖的提取率为1.15%，竹叶多糖的纯度为83.3%。

2.2 芦丁、葡萄糖、亚硝酸盐标准曲线的测定结果见表1。

表1 .芦丁、葡萄糖、亚硝酸盐标准曲线的测定结果

2.3 不同剂量Vc、竹叶黄酮和竹叶多糖清除亚硝酸盐的结果见表2、图1。

表2 .不同剂量Vc、竹叶黄酮和竹叶多糖对亚硝酸盐的清除率（%，n，X±S）

3 分析与讨论

3.1 由表2和图1测定结果见，竹叶黄酮对亚硝酸盐有较强的清除率，剂量从0.1mg增加到4.0mg，清除率从15.72%增加到84.59%，剂量和作用之间基本呈线性关系（r=0.9649）；剂量再增加到5.0 mg，清除率不再显著增加（P＞0.5）。竹叶多糖对亚硝酸盐也有一定的清除率，剂量从0.1mg增加到3.0mg，清除率从8.55%增加到36.10%，剂量和作用之间也呈线性关系 （r=0.9789）；剂量再增加到4.0mg和5.0mg，清除率并不继续增加（P＞0.4）。

3.2 Vc在体外对亚硝酸盐的清除率相当高，0.1mg剂量的清除率即达到61.24%，剂量增加到1.0mL时清除率已达到100%，故实验中Vc剂量不需再增加；清除率随剂量增加的曲线似抛物线形，（r=0.8678）；而且Vc对亚硝酸盐的清除率均显著高于同剂量的桂花黄酮和多糖（均 P＜0.01或 0.001）。

3.3 N-亚硝基化合物是一种致癌性很强的化合物，至今已经研究的近300种N-亚硝基化合物中，约90%以上具有致癌性，并证明N-亚硝基化合物可在体内外由其前体物胺类与硝酸盐或亚硝酸盐形成。正常情况下,人们直接从食物中摄入的亚硝胺和亚硝酰胺极少,但形成它们的前体物亚硝酸盐却大量存在于食物中,特别是亚硝酸盐在人和动物的胃中更适宜合成亚硝胺。因此，清除体内亚硝酸盐和阻断亚硝胺的合成是预防癌症的有效途径[5、6]。

许多学者研究了从天然植物中提取的黄酮类物质对亚硝化反应的抑制作用，认为阻断原理是：在模拟人体胃液的条件下，二甲胺与亚硝酸钠在37℃条件下，可适宜地生成二甲基亚硝胺，当往黄酮提取液中依次加入二甲胺与亚硝酸钠时，黄酮类物质优先同亚硝酸钠作用，使二甲胺不能与亚硝酸钠反应，达到阻止亚硝胺生成的目的[7]。

3.4 一些资料报道了竹叶黄酮清除亚硝酸盐的作用；据许刚等报道，竹叶的甲醇、乙醇、丙酮提取物浓度在0～146.3mg/mL时，对N-亚硝胺合成的阻断率在0～92.86%；浓度0～97.54mg/mL时，对亚硝酸盐的清除率在 0～90.07% （此时清除亚硝酸盐约 100μg）[8]。据楼鼎鼎等报道，肉制品中添加竹叶抗氧化物(AOB，其中总黄酮含量32.3%），可减少产品中亚硝酸盐的残留量，当AOB的添加量（以总黄酮计）为0.003%时，亚硝酸盐含量比对照降低16%；当AOB添加量0.01%时,则降低20%以上；说明AOB具有一定的清除亚硝酸盐的能力[9]。据吴洪报道，竹叶黄酮浓度从2.309增加到115.45（mg/mL），对亚硝酸盐的清除率从9.84%增加到89.32%[10]。吴洪等还从18种中药中提取黄酮，测定对亚硝酸盐的清除率，作用较好的是化橘红、橘皮、竹叶，黄芩、金钱草、甘草、桑白皮、桑椹黄酮类，对亚硝酸盐的清除率最大分别可达到93.16%、89.49%、89.32% 、80.82% 。77.37% 、75.07% 、69.71% 、67.85%[11]，竹叶黄酮的最大清除率与本实验结果基本一致。

3.5 许多植物多糖具有清除亚硝酸盐的作用，据李碧婵等报道，红菇多糖剂量从0.125mg/mL增至0.375mg/mL，对亚硝酸盐的清除率从15.72%显著增加到45.3%，再增加多糖剂量时清除率反而下降[12]。据冯翠萍等报道，灵芝孢子粉多糖从1.2增加到2.5（mg/mL）对亚硝酸盐的清除率从82.4%增加到88.3%[13]。据郭豫梅报道，0.164mg/mL的石参多糖对亚硝酸盐的清除率为37.56%[14]。据李利华等报道，120.5mg的鱼腥草多糖对15μg亚硝酸盐的清除率达到64.37%[15]。据但飞君等报道，红毛七多糖对多糖浓度为4.0mg/mL时,对的清除率达85.1%[16]。据王晓梅等报道，朱砂七多糖浓度为5mg/ml时,对亚硝胺合成的阻断率为41.27%；浓度为0.09mg/ml时，对亚硝酸盐的清除率最高，为67.03%[17]。据郭小鹏等报道，向25mL模拟胃液中加入50mg黄参多糖，反应15min，对亚硝酸盐清除率可达86.6%[18]。据李志英等报道，加入β-环糊精能使黄芪多糖对亚硝酸盐的清除能力从29.1%提高到50.2%[19]。据张庭廷等报道，0.25mg 和 0.5mg 的枸杞多糖、金樱子多糖、茶多糖对20μg亚硝酸盐的清除率分别为 53.36% 和 99.72% 、48.29% 和 88.97% 、50.27% 和91.45%[20]。关于竹叶多糖清除亚硝酸盐，目前尚未见报道，本文首次报道竹叶多糖清除亚硝酸盐的作用，但清除率显著小于竹叶黄酮和 Vc（均 P＜0.01或0.001），也小于大部分植物多糖对亚硝酸盐的清除率。

[1] 陆志科，谢碧霞.竹叶化学成分的分析与资源的开发利用[J].林业科技开发,2003(01).

[2] 吴三林，李书华，弓加文.竹叶活性成分的研究进展[J].乐山师范学院学报,2005(05).

[3] 李飞跃，喻国光，陈金珠，等.竹叶主要化学成分分析及其生物活性研究现状[J].江西林业科技，2006(42).

[4] 姚曦，岳永德，汤锋，等.竹叶活性成分的研究进展[J].林产化学与工业,2009(06).

[5] 周才琼，周张章，范勇，等.不同茶样冲泡浸出液对NO－2清除作用的体外试验研究[J].茶叶科学，2004，24(3)：201－206.

[6] 赵甲元，贾冬英，姚开，等.亚硝胺体内外合成阻断作用的研究[J].食品与发酵科技，2010，46(1)：35－38.

[7] 张庆乐，吴守林，张丽青，等.植物黄酮在抑制亚硝化反应中的应用[J].医药导报，2009，28（6）：733－734.

[8] 许刚,张虹,庞洁.竹叶提取物对亚硝化反应抑制作用的研究[J].郑州工程学院学报，2001，22(1)：69－72.

[9] 楼鼎鼎，戚炯炯，张英，等.竹叶抗氧化物在双汇西式肉制品中的应用研究[J].中国食品学报，2006，6（3）：111－114.

[10] 吴洪.竹叶、竹茹对亚硝酸盐的清除能力与总黄酮含量的相关性[J].宜春学院学报.2010，32（8）：48－49.

[11] 吴洪，高平章.18种中药材对亚硝酸盐清除活性与黄酮含量相关性研究 [J].安徽农业科学，2011,39 （24）：14636－14638.

[12] 李碧婵，李淼，王贺祥.红菇子实体多糖的提取及其抗氧化活性研究[J].中国食用菌，2012，3（1）：42～45.

[13] 冯翠萍，王晓闻，程旭东，等.灵芝孢子粉多糖的提取及其生物活性研究[J].中国食品学报，2009，9（3）：58－61.

[14]郭豫梅.野生石参中多糖含量的测定及抗氧化活性的研究[J].食品工业科技，2011，32（6）：93－95.

[15] 李利华.鱼腥草多糖体外抗氧化活性研究[J].安徽农业科学，2012，40（6）：3286－3288.

[16] 但飞君,禇立军，蔡正军，等.红毛七多糖体外抗氧化活性研究[J].江苏农业科学,2010(5)：398－400.

[17]王晓梅，李宗孝，任莉君.朱砂七多糖的抗氧化作用研究[J].安徽农业科学，2010，38(34)：19346－19347.

[18] 郭小鹏，田呈瑞，高春燕，等.黄参粗多糖脱蛋白工艺以及对亚硝酸盐清除作用的研究 [J].食品工业科技，2011，32（2）:274－276.

[19] 李志英，程丽丽.β－环糊精介质中提取的黄芪多糖对亚硝酸根的清除作用[J].食品与发酵工业，2011，37（2）：70－72.

[20] 张庭廷，聂刘旺，陶瑞松，等.三种植物多糖抗氧化活性研究[J].安徽师范大学学报（自然科学版），2002，25（1）：56－58.