组织工程用纳米纤维支架制备方法的进展

刘淑琼 许祯毅

（1.武夷学院 生态与资源工程系，福建 武夷山 354300；2.武夷山市质量计量检测所，福建 武夷山 354300）

前言

组织工程(tissue engineering)是用生命科学和工程学的原理及技术，构建、培育活组织，研制生物替代品以修复或重建组织器官的结构，维持或改善组织器官功能的一门新兴的边缘学科[1]。它包括三大要素：支架材料、种子细胞和细胞因子。支架材料在组织工程中起重要作用，因为贴壁依赖型细胞只有在材料上黏附后，才能增殖、生长和分化，而细胞的增殖、生长和分化则是组织形成的必经过程，很多文献都证明了纳米纤维结构对细胞的这一系列行为有着重要的影响[2]。作为支架材料应具备有以下性能[3－5]：(1)材料应在结构和功能上与天然细胞外基质相似，具有良好的生物相容性；(2)良好的骨传导性和骨诱导性；(3)可降解性；(4)具有三维立体结构，孔径的大小要与细胞体积相一致；(5)易于塑型性和有一定的机械强度；(6)具有负荷最大量细胞的高渗透性；(7)可与其他活性分子如骨形态发生蛋白(BMP)、转移生长因子－p(TGF－p)复合共同诱导骨发生。其中高孔隙率的联通网络结构可保证支架内细胞和周围宿主组织间正常的物质运输，并为毛细血管的长入提供空间。而纳米纤维材料因具有高的比表面积、高孔隙率、高的表面能、小尺寸效应和表面效应，及与天然细胞外基质相似的结构特点等优点，可以为细胞在体外的生长、发育和细胞间通讯提供理想的微环境。因此，模仿天然细胞外基质中胶原的结构制成的含纳米纤维的生物可降解材料，将在组织工程中具有良好的应用前景，成为组织工程支架材料的一个新的研究方向。

目前，有很多不同的制备技术可以用来制备聚合物纳米纤维，这些方法各式各样，包括物理的、化学的、热力学的以及静电作用的等制备技术[6－8]。本文就纳米纤维的各种制备方法及其优缺点做一综述如下，并将其优缺点归纳如表1。

1 纳米纤维制备方法

1.1 静电纺丝

静电纺丝是一种用来制备超细纤维的技术，其纤维大小包括微纤维(＞1mm)和纳米纤维(＜1000 nm)[9]，制备装置如图1所示。其原理就是向聚合物溶液或熔体提供一个高压，使其克服表面张力形成一股带电射流，聚合物溶液或熔体经过喷射，在接地接收板上进行收集、干燥、固化。聚合物溶液或熔体喷出到接受板的过程中，射流就存在相互排斥的作用，所以在溶剂挥发后就形成细纤维。因此，通过控制纺丝条件就可以获得直径大小为0.02-20μm的纤维。当接受板静止不动时，得到的纤维就会因为聚合物静纺溶液的随机移动而堆积沉积在接受板上。然而，如果用接地电的转筒作为收集器，那就可以得到取向的纤维[10]。

已有较多的材料通过静纺形成纳米纤维应用于组织再生支架[11,12]。应用于静电纺丝的材料有天然材料包括胶原、壳聚糖和蚕丝蛋白等、合成可生物降解的材料有PGA、PLGA、PLLA和PCL等及二者的复合物[11,13-15]。另外，像生长因子、蛋白质和羟基磷灰石等生物活性物质也可在静电纺丝中复合到纳米纤维材料中[15,16]。因此，静电纺丝纳米纤维生物材料已开始被设计成各种组织。但是，采用该技术制备成具有复杂三维结构或者是形成理想的孔洞结构的支架时受到了明显的挑战，因此就限制了其在组织工程中的应用。

表1 、聚合物纳米纤维支架制备方法的比较Comparison of methods for fabricating polymer nanofiber scaffolds

1.2 分子自组装

纳米纤维基体还可以通过分子自组装的方法来制备，主要包括单个分子自组装形成固定的组织和利用非共价键作用(包括氢键、离子键、疏水作用等)稳固层次结构两个过程[17,18]。核酸和蛋白质合成及自组装等自然过程，一般都包含细胞外基质(ECM)的一些特殊生物成分及模仿ECM的自组装过程。

自组装分子的一些特定基团也需要被组装进纳米纤维。例如：自组装肽两亲分子(PAs)有一些关键性的结构特征：长的烷基链是用来传递疏水作用这个自组装驱动力的；残留的四个连续半胱氨酸是用来创造形成聚合物结构的二硫键的；三个残留甘氨酸的连接区域为亲水基团提供了灵活性；残留的磷酸化丝氨酸在矿化过程加强了同钙离子的相互作用；精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸肽系列 (RGD)会增加细胞的黏附[19]。PAs在酸性条件下会自组装形成直径为5-8 nm，长度为1μm的纳米纤维。这过程包含着用二硫苏糖醇调控PA溶液的pH从8降到4。当溶液酸化后，PAs就迅速变成不溶解的状态，并形成纳米纤维凝胶。除了pH的影响外，PAs的自组装也可以通过干燥和引入二价离子(比如Ca2+)来获得[20]。E.Beniash等报道自组装水凝胶可以利用多价金属离子作为媒介来诱捕细胞，并且该支架能够支持成骨细胞(MC3T3-E1)生存三个星期[21]。

Zhang等合成了离子自给的寡生肽，其结构是由亲水氨基酸和疏水氨基酸交替重复的规整结构。在水里，寡胜肽就形成β态，并且呈现出极性表面(带电离子链)和非极性面(丙氨酸)。当暴露在一价碱性阳离子或者是生理环境的条件下，寡胜肽就迅速自组装成为各种形态的水凝胶[89]。这些水凝胶是由互相交织的纳米纤维网络构成的，其纤维直径为10-20 nm，纤维间的间隙大约50-200 nm；纳米纤维基体能够支持哺乳类细胞的黏附、增殖和分化[23]。

除PAs和寡胜肽外，合成二嵌段/三嵌段共聚物[24]和树枝状聚合物[25]都可以自组装形成纳米纤维结构。然而作为再生生物材料，自组装纳米纤维支架在当前却受限于生物学分子，比如水凝胶的肽[18]，不能形成力学稳固的三维结构的支架。肽纳米纤维容易形成碎片，而且容易受到胞吞作用的影响[21]。另外，此类支架的降解还没有被系统的报道过。肽主链结构的降解是通过酶起作用的，因此就不能随意控制他们在体内的降解行为了。

1.3 相分离

相分离法是制备微孔膜或多孔支架的一种常用方法，在高温下均相的聚合物溶液通过冷却发生相分离，形成富聚合物和富溶剂的双相，冷冻干燥脱出稀释剂后，富溶剂相脱除，剩余空间形成孔隙，富聚合物相则凝固形成支架骨架[26]。图2[27]是聚合物溶液的温度-浓度相图，当聚合物体系落于双节线和旋节线之间的亚稳区时，体系通过成核-生长机理分相，制备的支架形成孤立的闭孔结构；当体系落于旋节线下的非稳定区，通过旋节线机理分相，制备出的支架有着相互贯通的孔结构。各种各样的生物降解聚合物都可以通过相分离技术制备成三维多孔支架[28,29]，通过控制聚合物体系和相分离条件，各种形貌和孔结构的支架都可以制备出来，而且都已经应用于组织再生的研究。

但是早期采用相分离制备的支架一般都是实壁结构，在模拟天然细胞外基质的胶原结构上还存在着较大差距。为了制得模仿天然胶原的纤维状结构的支架，研究者采用改进的热致相分离技术来达到这一目的。Peter等人[2]在这一方面做了大量的研究，首次采用相分离法制备了PLLA纳米纤维支架，其纤维直径在50-500 nm范围内。研究发现：纳米级纤维基质可由聚合物溶液经过热致凝胶化、溶剂抽提和冷冻干燥等过程制备。在冷冻干燥前，聚合物浓度、热退火、溶剂交换和冷冻温度对纳米级结构均有影响。但所制备的纤维基体却缺乏大孔结构(100μm)，为了克服该缺点，Peter课题组就将粒子粒滤技术与相分离技术相结合，采用不同的的致孔剂(水溶性的糖或氯化钠)进行致孔，除掉致孔剂，就得到有着连通性良好的大孔结构的纳米纤维支架，通过控制糖或NaCl的外观形貌、尺寸来调节支架的大孔结构[30]。为了模拟I型胶原的纳米纤维基质结构，Chen VJ[31]等人利用相分离联合粒子粒滤法制备了具有高度连通的球形中孔和纳米纤维状的网络结构的支架。其方法是先制备石蜡微球，然后热致联结使其形成相互连接的模型，然后浇铸PLLA溶液，用热致相分离的原理促使形成纳米纤维状基质；再滤出石蜡微球就合成了带有相互连通球形孔的纳米纤维状的细胞外基质的结构。这种相互连通的中孔结构能够促进细胞在整个支架空隙中的传播，有利于后期的分化、增殖，即合成出了类似天然细胞外基质胶原结构的支架。Yang F等[32]采用液液相分离的方法，制备了高度多孔和纤维直径在纳米级的PLLA支架，随后在此支架上进行神经干细胞的体外培养，实验显示神经干细胞能够识别纳米结构的支架，并且有利于神经突的生长。

为了使支架更适用于临床，Peter课题组结合计算机辅助，将热致相分离技术与固体自由成型技术(solid freeform fabficmion，SFF)相结合，制备出具有大孔或微孔的复杂三维结构的PLLA纳米纤维支架，通过组织切片与计算机断层扫描摄影，明确所要构建的支架的精细结构，再利用控制热致相分离方法的各种参数，精确制备具有纳米纤维结构的支架[33]；或者是通过三维立体打印机得到所需要构建的支架影像，再通过控制相分离技术的实验条件来制备合适的支架[34]，为快速地修复组织损伤创造了可能性。

但是现有采用相分离方法制备纳米纤维支架的材料却仅仅局限于聚乳酸等少数结晶性合成聚合物[2,35]，而有研究表明聚乳酸或是聚乙醇酸制备的纳米纤维支架的降解实验在一个星期中就表现为支架大范围的收缩，这将限制其在组织工程中的应用，而由静电纺丝制备得到的聚己内酯纳米纤维支架却能够在降解实验中维持良好的形态，为细胞繁殖和分化提供一个良好的载体[36]。因此，开发新的合成聚合物作为相分离法制备纳米纤维支架的材料将是一个很有意义的工作。

1.4 细菌纤维素

细菌产生纳米纤维的纤维素早就应用于各个领域，包括生物学应用等[37]。醋酸杆菌合成纤维素包括细胞外基质葡糖聚合成链，然后链自组装和结晶化形成不同级别的带。细菌纤维素形成的纳米纤维支架很容易生成100 nm以下的纤维直径，而且不同的菌株会生成不同特点的纤维[38]，还可以通过在细菌生产纤维素的生长介质中加入聚合物形成共聚物纳米纤维支架[39]。图3所示为醋酸杆菌沉积纤维素纳米纤维的过程。

1.5 模板法

聚合物纳米纤维还可采用模板法来制备，例如以自我有序多孔氧化铝为模板。首先要制备孔径大约为25-400 nm，孔深为100 nm-100μm的铝网络结构的模板。聚合物纳米纤维阵列可以通过破坏模板或者机械分离模板得到，如图4所示[40]。铝模板制备的PCL纳米纤维支架的纤维长度可以通过熔融时间和温度等参数来控制[41]。

1.6 提拉法

纳米纤维可以直接通过机械拉伸黏性聚合物流体得到[42]。如图5所示，纳米纤维可以直接拉伸得到：把一根放置在聚合物流体上，然后向上提拉形成一根单丝，冷却后就形成了纳米纤维。Xing X等用该方法制备了纤维直径在60 nm以下，长达500 nm的聚三甲烯对苯二酸酯的纳米纤维支架[43]。有一种自动拉伸技术是利用移液管间歇滴涂聚合物流体溶液到基底上，然后使基底沿着x-y的方向交叉来回移动，这个过程会使连接纳米纤维的管接头处形成圆状微粒[44]。这种方法已用来制备高度有序的聚苯乙烯纳米纤维支架，其直径大小变化从几纳米到几微米。

1.7 提取法

纳米纤维还可以用化学和机械处理的方法从天然材料中提取。例如植物纤维素就可以从破碎的植物细胞壁中得到。例如有研究者就从麦秆和大豆中提取了直径为10-120 nm，长度为几千纳米的纤维素纳米纤维[45]。无脊椎动物也是纳米纤维提取的一个来源。从乌贼提取的甲壳素纳米纤维直径为3-4 nm，长度有几微米[46]；从海生硅藻提取的聚乙酰葡萄糖胺纳米纤维证明对红血球具有高凝作用[47]。

1.8 气相聚合

聚合物纳米纤维也可以通过气相聚合制备得到。等离子诱导乙烯基三氯硅烷气相聚合形成的硅氧烷纤维直径大约25 nm，长度约400-600 nm；氰基丙烯酸酯气相聚合形成的纳米纤维直径约100-400 nm，长度达几百微米[48,49]。

2 结论

组织修复工程中，纳米纤维支架由于具有高的比表面及类似于细胞外基质结构，而被证明更有利于细胞的粘附，繁殖及分化。静电纺丝法、分子自组装、热致相分离法都是较常用的制备纳米纤维支架的方法。其中，热致相分离法由于设备简单，耗用低、可以通过控制实验参数制备出三维复杂结构的多孔纳米纤维支架，表现出很大的潜力，但是热致凝胶化的相分离方法的机理还有待进一步的研究。

[1]Healy KE,Guldberg RE.Bone tissue engineering[J].JMusculoskelet Neuronal Interact,2007,7(4):328-330.

[2]Ma PX,Zhang RY.Synthetic nano-scale fibrous extracellular matrix.Journal of Biomedical Materials Research,1999,46(1):60-72.

[3] 郭文锦,潘巨利.骨组织工程支架材料的研究进展[J].北京口腔医学.2009,17(1):55-57.

[4] 孙宁宁,等.骨组织工程支架材料的研究进展[J].国际生物医学工程杂志,2007,30(4):251-254.

[5] 陈艳梅,奚廷斐,郑裕东.骨组织工程支架材料及其相关的研究进展[J].北京生物医学工程,2008,27(5):541-546.

[6] Venugopal J,Low S,Choon AT,Ramakrishna S.Interaction of cells and nanofiber scaffolds in tissue engineering[J].J.Biomed.Mat.Res.B Appl.Biomater.,2008,84:34-48.

[7] Ma Z,Kotaki M,Inai R,Ramakrishna S.Potential of nanofiber matrix as tissue-engineering scaffolds[J].Tissue Eng,2005,11:101-109.

[8]Vasita R,Katti DS.Nanofibers and their applications in tissue engineering[J].Int.J.Nanomed.,2006,1:15-30.

[9]Reneker D H,Chun I.Nanometre diameter fibres of polymer produced by electrospinning[J].Nanotechnol,1996,7:216-223.

[10] Matthews JA,Wnek GE,Simpson DG,Bowlin GL.Electrospinningof collagen nanofibers[J].Biomacromolecules,2002,3:232-238.

[11]Xu CY,Inai R,Kotaki M,et al.Scaffold for Blood Vessel Engineering[J].Biomaterials,2 004,25:877-886.

[12]Nair LS,Bhattacharyya S,Laurencin CT.Development of novel tissue engineering scaffolds via electrospinning[J].Expert Opin.Biol.Ther.,2004,4:659-668.

[13]Yang F,Murugan R,Wang S,Ramakrishna S.Electrospinning of nano/micro scale poly(L-lactic acid)aligned fibers and their potential in neural tissue engineering[J].Biomaterials,2005,26(15):2603-2610.

[14]Boland ED,Wnek GE,Simpson DG,Pawlowski KJ,Bowlin GL.Tailoring?tissue engineering scaffolds using electrostatic processing techniques:a study of poly(glycolic acid)electrospinning[J].J.Macromol.Sci.,Pure Appl.Chem.,2001,38:1231-1243.

[15]Luu YK,Kim K,Hsiao BS,Chu B,Hadjiargyrou M.Development of a nanostructured DNA delivery scaffold via electrospinning of PLGA and PLA–PEG block copolymers[J].J.Control Release,2003,89:341-353.

[16]Li C,Vepari C,Jin HJ,Kim HJ,Kaplan DL.Electrospun silk-BMP-2 scaffolds for bone tissue engineering[J].Biomaterials,2006,27:3115-3124.

[17]Whitesides GM,Grzybowski B.Self-assembly at all scales[J].Science,2002,295:2418-2421.

[18]Zhang SG.Emerging biological materials through molecular self-assembly[J].Biotechnol,Adv.,2002,20:321-339.

[19]Hartgerink JD,Beniash E,Stupp SI.Self-Assembly and Mineralization of Peptide-Amphiphile Nanofibers[J].Science,2001,294(5527):1684-1688.

[20]Hartgerink JD,Beniash E,Stupp SI.Peptide-amphiphile nanofibers:a versatile scaffold for the preparation of selfassembling materials[J].Proc.Natl.Acad.Sci.USA,2002,99:5133-5138.

[21]Beniash E,Hartgerink JD,Storrie H,Stupp SI.Self-assembling peptide amphiphile nanofiber matrices for cell entrapment.Acta Biomaterials,2005,1:387-397.

[22]Holmes TC,de Lacalle S,Su X,Liu GS,Rich A,Zhang SG.Extensive neurite outgrowth and active synapse formation on self-assembling peptide scaffolds[J].Proc.Natl.Acad.Sci.USA,2000,97:6728-6733.

[23]Zhang SG,Holmes TC,Dipersio CM,Hynes RO,Su X,Rich A.Self-complementary oligopeptide matrices support mammalian-cell attachment[J].Biomaterials,1995,16:1385-1393.

[24]Liu G.nanofiber[J].Adv.Mater.,1997,5(9):437-439.

[25] Liu DJ,Feyter SD,Coltler M,Wiesler UM,Weil T,Herrmann A,Mullen K,Schryver FCD.Macromolecules,2003,36:84-89.

[26]Nam YS,Park TG.Biodegradable polymeric microcellular foams by modified thermally induced phase separation methods[J].Biomaterials,1999,20(19):1783-1790.

[27]王克敏,李世荣,等.热致相分离技术制备组织工程支架[J].化学与生物工程,2006,239(1):1-3.

[28] Zhang R,Ma PX.Poly(alpha-hydroxy acids)/hydroxyapatite porous composites for bone tissue engineering.Ⅰ.Preparation and morphology[J].J.Biomed.Mat.Res.,1999,44(4):446-455.

[29] Wei GB,Ma PX.Structure and properties of nano-hydroxyapatite/polymer composite scaffolds for bone tissue engineering[J].Biomaterials,2004,25(19):4749-4757.

[30]Zhang RY,Ma PX.Synthetic nano-fibrillar extracellular matrices with predesigned macroporous architectures[J].Journal of Biomedical Materials Research,2000,52(2):430-438.

[31]Chen VJ,Ma PX.Nano-fibrous poly(L-lactic acid)scaffolds with interconnected spherical macropores[J].Biomaterials.2004,25(11):2065-2073.

[32]Yang F,Murugan R,Ramakrishna S,Wang X,Ma YX,Wang S.Fabrication of Nano-structured Porous PLLA Scaffold intended for Nerve Tissue Engineering[J].Biomaterials,2004,25(10):1891-1900.

[33]Chen VJ,Smith LA,Ma PX.Bone regeneration on computer-designed nano-fibrous scaffolds[J].Biomaterials,2006,27:3973-3979.

[34]Wang P,Hu J,Ma PX.The engineering of patient-specific anatomically Shaped digits[J].Biomaterials,2009,30(14):2735-2740.

[35]He LM,Zhang YQ,Zeng X,Quan DP,Liao SS,Zeng YS,Lu J,Ramakrishna S.Fabrication and characterization of poly(L-lactic acid)3D nanofibrous scaffolds with controlled architecture by liquid–liquid phase separation from a ternary polymer–solvent system[J].Polymer,2009,50(16):4128-4138.

[36] Flemming RG,Murphy CJ,Abrams GA,Goodman SL,Nealey PF.Effects of synthetic micro-and nano-structured surfaces on cell behavior[J].Biomaterials,1999,20(6):573-588.

[37] Ji Y,Ghosh K,Shu XZ,Li B,Sokolov JC,Prestwich GD,Clark RA.Rafailovich MH.Electrospun three-dimensional hyaluronic acid nanofibrous scaffolds[J].Biomaterials,2006,27:3782-3792.

[38] Czaja WK,Young DJ,Kawecki M,Brown Jr RM.The future prospects of microbial cellulose in biomedical applications[J].Biomacromolecules,2007,8:1-12.

[39]Brown EE,Laborie MP.Bioengineering bacterial cellulose/poly(ethylene oxide)nanocomposites[J].Biomacromolecules,2007,8:3074-3081.

[40]Porter JR,Henson A,Popat KC.Biodegradable poly(epsiloncaprolactone)nanowires for bone tissue engineering applications[J].Biomaterials,2009,30:780-788.

[41]Tao SL,Desai TA.Aligned arrays of biodegradable poly(epsiloncaprolactone)nanowires and nanofibers by template synthesis[J].Nano Lett,2007,7:1463-1468.

[42]Jeong HE,Lee SH,Kim P,Suh KY.Stretched polymer nanohairs by nanodrawing[J].Nano Lett,2006,6:1508-1513.

[43]Xing X,Wang Y,Li B.Nanofibers drawing and nanodevices assembly in poly(trimethylene terephthalate)[J].Opt.Express,2008,16:10815-10822.

[44] Nain A,Wong J,Amon C,Sitti M.Drawing suspended polymer micro-/nanofibers using glass micropipettes[J].Appl.Phys.Lett.,2006,89:183105-183107.

[45]Alemdar A,Sain M.Isolation and characterization of nanofibers from agricultur residues:wheat straw and soy hulls[J].BioresourTechnol,2008,99:1664-1671.

[46]Fischer TH,Valeri CR,Smith CJ,Scull CM,Merricks EP,Nichols TC,et al.Non-classical processes in surface hemostasis:mechanisms for the poly-N-acetyl glucosamine-induced alteration of red blood cell morphology and surface prothrombogenicity[J].Biomed.Mater.,2008,3(1):15009.

[47]Fan Y,Saito T,Isogai A.Preparation of chitin nanofibers from squid pen beta-chitin by simple mechanical treatment under acid conditions[J].Biomacromolecules,2008,9:1919-1923.

[48]Rollings DA,Tsoi S,Sit JC,Veinot JG.Formation and aqueous surface wettability of polysiloxane nanofibers prepared via surface nitiated,vapor-phase polymerization of organotrichlorosilanes[J].Langmuir,2007,23:5275-5278.

[49]Mankidy P,Rajagopalan R,Foley H.Facile catalytic growth of yanoacrylate nanofibers[J].Chem.Commun,2006,1139-1141.