蒙古族耳聋患者中常见致聋基因突变分析

鲍晓林 郭家亮 郭玉芬

耳聋基因在遗传性聋患者中具有较高的遗传异质性，在不同地区和不同人群中耳聋基因的突变频率、突变方式和热点突变有很大差异。目前普遍认为GJB2基因、SLC26A4基因、线粒体DNA12Sr RNA是常见的致聋基因，也是中国耳聋人群中突变携带率最高的致病基因，而且不同地域、不同民族也有其自身的特点，但国内相关研究绝大部分是在汉族人群中进行的，对少数民族耳聋人群中常见耳聋基因的分子流行病学研究相对较少。我国是多民族的国家，随着聋病基因筛查工作的不断深入，越来越多的少数民族聋病资源被发现，为了探讨不同民族聋病常见基因突变特点，了解常见耳聋基因突变在不同民族间的分子流行病学特点，揭示少数民族耳聋患者的遗传学机制，制定个性化的基因筛查和聋病分子诊断流程，本研究对耳聋分子流行病学调查中发现的64例蒙古族耳聋先证者资料进行分析，以了解蒙古族人群耳聋基因的分布特点。

1 资料与方法

1.1研究对象 蒙古族非综合征型聋患者64例，其中男34例，女30例，年龄7～21岁，中位年龄13岁，语前聋54例，语后聋6例(小于或等于2岁者判定为语前聋，2岁以后出现的听力下降者判定为语后聋)，余4例发病年龄不明确。有氨基糖苷类抗生素应用史23例(占36.4%)，有耳聋家族史6例(9.4%)。根据世界卫生组织《障碍、残疾和残废的国际分类》(1997)对语言频率听力损失划分标准分级：轻度聋(听力损失26～40 dB HL)、中度聋(41～60 dB HL)、重度聋(61～80 dB HL)、极重度聋(>81 dB HL)及全聋，64例中，重度聋24例，极重度聋40例。

排除标准：有典型的慢性化脓性中耳炎表现、听力检查为传导性听力下降或有中耳手术史，有较重的颅脑外伤或耳外伤史，综合征型聋，中枢性疾病、脑瘫等智力障碍引起的语言障碍患者。

1.2调查方法 对64例患者进行全身及耳鼻咽喉科常规检查，并进行纯音听阈、中耳功能ABR和耳声发射等检查，判断是否存在蜗后病变。在知情同意的前提下，抽取外周静脉血5 ml，制备基因组DNA，应用紫外分光光度计检验样本纯度，并建立耳聋基因数据库[1,2]。

1.3实验方法 针对GJB2基因在第二个外显子的编码区进行扩增[3]，引物序列为GJB2-F：GGTGTTTGCTCCAGGAAGA, GJB2-R：GGCCTACAGGGGTTTCAAAT，PCR产物片段大小为843 bp。用25 μl PCR反应体系在ABI公司9700热循环仪完成。反应条件：10×Buffer 2.5 μl ，dNTP(2.5 mM/ul)2 μl ,20 μM/μl primers 0.5 μl ,rTag酶0.5 μl ，100 ng DNA Template 1 μl ，ddH2O 18 μl 。反应条件：94 ℃预变性5 min,94 ℃变性30 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s,30个循环，反应结束后再72 ℃延伸7 min,4 ℃保存。产物经测序检测突变。

针对线粒体1555位点设计引物，F:TGCTTACCCAGACTCGAGAA，R: CGACTGAGCCTTGACAGCTGA，PCR产物片段大小为801 bp。PCR反应采用25 μl 反应体系，10×Buffer 2.5 μl ，2.5 μM dNTP2 μl ，20(M primers 0.5 μl ，rTaq酶0.5 μl ，100 ng DNA Template 1 μl ，ddH2O 18 μl。反应条件：95 ℃预变性5 min，95 ℃变性30 s，58 ℃退火45 s，72 ℃延伸45 s，30个循环，反应结束后再72 ℃延伸7 min，4 ℃保存，产物送测序检测突变。

SCL26A4基因突变分析方法：应用解放军总医院国家北方基因研究中心的20对引物序列和反应条件[4]，分别进行扩增反应，然后取PCR产物和标准Marker各2 μl ，分别加入6 μl 溴酚蓝，用1.5%琼脂糖凝胶进行产物纯度和浓度的检测，产物送测序检测突变。

2 结果

GJB2基因：235delC纯合突变2例(图1)，299-300delAT和176-191del 16bp(图2)复合杂合突变1例，235delC与176-191del 16bp复合杂合突变1例，478G>A/wt杂合突变1例，79G>A和/或341A>G遗传多态性改变31例，占48.4%。突变率为7.81%(5/64)，等位基因携带率为5.46%(7/128)。

mtDNA12SrRNA 1555和1494位点未发现突变。

图1 235delC突变测序图：纯合突变(中)、杂合突变(上)、正常对照(下)

图2 299-300delAT突变测序图：杂合突变(下)、正常对照(上)，序列方框标识为缺失的16个碱基位置

图3 SLC26A4基因IVS7-2A>G突变测序图：正常对照(下)、杂合突变(上)、纯合突变(中)

SLC26A4基因：919-2A>G/919-2A>G纯合突变4例(图3)；复合杂合突变4例，分别为2027 T>A/919-2A>G 2例、2169A>G/919-2A>G 2例；杂合突变7例，分别为919-2A>G/wt 4例，918+1delG/wt、1238G>A/wt和2027 T>A/wt各1例。突变率为23.44% (15/64)，等位基因携带频率为17.99%(23/128)。

本组64例患者中共检测出GJB2、SLC26A4、线粒体DNA12SrRNA三种基因突变者20例，其中SLC26A4基因突变率最高(75%，15/20)，其中919-2A

3 讨论

我国地域辽阔，民族众多，各地区经济和意识形态的发展极不均衡，少数民族的遗传背景存在明显的差异性。针对全国不同区域、不同民族的耳聋人群进行深入的研究，掌握确凿的听力学和遗传学数据，明确少数民族耳聋基因突变的频率、特定耳聋基因突变和多态性特点等，能够为耳聋基因筛查和基因诊断提供详细的参考依据，制定个性化的遗传咨询服务，指导优生优育。

蒙古族主要集中聚居在内蒙古自治区，在河北、辽宁、吉林、黑龙江以及新疆等省自治区也有蒙古族聚居区。本组64例蒙古族耳聋患者均来自在内蒙古自治区，从病史、发病年龄、听力学特点来看无特异性。本组中蒙古族耳聋患者的三种常见耳聋基因突变的发生率与文献报道的汉族和其他少数民族的常见耳聋致病基因突变频率分布有所不同[5～8]，235delC基因突变携带率4.7%(3/64)，是本组中GJB2基因最多见的突变位点，占全部突变的15%(3/20)； SLC26A4基因919-2A>G是突变检出率最高的位点，突变携带率为18.6%(12/64)，占全部突变的60%(12/20)，三种常见致病基因中SLC26A4基因是本组中突变率最高的，占全部突变的75%，其次为GJB2基因(25%)，而线粒体DNA 12SrRNA 1555位点和1494位点均未检测到突变。可见耳聋基因突变有明显的种族差异，而且突变频率有较大的地域差异[5，6]。蒙古族和汉族同属于蒙古人种，除外种族起源和始祖效应的因素，分析其原因还有以下几点：一是本组观察的样本量较少，难免造成统计结果的偏差，还需要扩大样本量，进行更深入的研究证实；二是本实验未统计与药物性聋相关的961和7445等位点；三是由于遗传异质性、遗传漂变和先证者效应等遗传学的不确定因素，还可能存在基因修饰或其他尚未发现的调节因素。由于长期进化形成各人种间的遗传差异，人群的大规模迁移、不同种族之间的婚配、融合又使得不同种群的遗传背景变得更为复杂，从而造成了不同地域、不同民族、不同种群之间的遗传学特点各不相同。遗传学的始祖效应和遗传漂变的原因使得遗传信息发生聚集或遗传力降低，从而出现了遗传携带频率的变化。蒙古族人线粒体基因研究能否成为耳聋基因研究的突破口，还需要更深入的探索，期望通过对蒙古族人的致聋基因的研究，从分子水平上认识蒙古族人在遗传素质上与其他种族的不同，为更好的开展基因诊断和治疗提供指导。

4 参考文献

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2 Guo YF, Liu XW, Guan J , et al . GJB2, SLC26A4 and mitochondrial DNA A1555G mutations in prelingual deafness in Northern Chinese subjects [J]. Acta Otolaryngology, 2008,128:297.

3 鲍晓林，郭玉芬,刘晓雯.29个近亲结婚致聋核心家系GJB2、SLC26A4和线粒体DNA12SrRNA基因分析[J].听力学及言语疾病杂志,2008,16:92.

4 Wang QJ, Zhao YL, Rao SQ, et al. A distinct spect rum of SLC26A4 mutations in patients with enlarged vestibular aqueduct in China[J] . Clinical Genetics,2007,72:245.

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