TWEAK和Fn14在腰椎间盘退变髓核组织中的表达及意义

陈春永，沈正清，叶君健*

(1.福建医科大学附属第一医院骨科，福建福州350005;2.福建晋江市医院骨科，福建晋江362200)

TWEAK和Fn14在腰椎间盘退变髓核组织中的表达及意义

陈春永1，沈正清2，叶君健1*

(1.福建医科大学附属第一医院骨科，福建福州350005;2.福建晋江市医院骨科，福建晋江362200)

目的 研究TWEAK和Fn14在腰椎间盘退变髓核组织中的表达及其临床意义。方法 用半定量RT-PCR和免疫组织化学法检测实验组(30例退变腰椎间盘)和对照组(10例创伤腰椎间盘)中TWEAK和Fn14mRNA及蛋白表达。结果 实验组TWEAKmRNA表达显著高于对照组(0.949±0.093vs0.653±0.110，P＜0.01)，实验组TWEAK蛋白表达显著高于对照组(0.682±0.126vs0.397±0.057，P＜0.01)，实验组Fn14mRNA表达显著高于对照组(0.936±0.125vs0.632±0.059，P＜0.01)，Fn14蛋白表达显著高于对照组(0.540±0.051vs0.344±0.072，P＜0.01)。结论 TWEAK和Fn14的表达增加可能参与腰椎间盘退变的进程。

肿瘤坏死因子样凋亡微弱诱导剂;成纤维细胞因子诱导14;椎间盘;椎间盘退变

肿瘤坏死因子样凋亡微弱诱导剂(TNF-like weak inducer of apoptosis，TWEAK)是肿瘤坏死因子超家族(tumor necrosis factor superfamily，TNFSF)的新成员，最早于1997年报道［1］，具有广泛的生物学活性，参与了细胞增殖迁移［2－3］、诱导血管生成［5］、炎性反应［5］及诱导凋亡［6］等病理过程。成纤维细胞因子诱导14(fibroblast growth factor-inducible 14，Fn14)为TWEAK的受体。本研究旨在检测腰椎间盘突出症(lumbar disc herniation，LDH)患者退变腰椎间盘组织中TWEAK和Fn14的表达，初步探讨TWEAK和Fn14与椎间盘退变(intervertebral disc degeneration，IDD)发病的相关性，进而为临床治疗提供新的思路。

1 材料与方法

1.1 标本来源

实验组:腰椎间盘退变髓核组织，取自2009年11月－2010年6月期间在福建医科大学附属第一医院骨科住院手术的LDH患者，有典型临床症状和体征，并经磁共振(magnetic resonance imaging，MRI)确认，无明显的全身性免疫性疾病和急慢性感染，共30例(男性19例，女性11例)，平均年龄(49.6±13.0)(16～75)岁。对照组:腰椎间盘创伤髓核组织，取自2009年11月－2010年6月期间在福建医科大学附属第一医院骨科住院手术的腰椎创伤患者，外伤至手术不超过3 d，MRI检查确认椎间盘无明显退变，伤前无长期腰腿疼痛、全身性免疫性疾病和明显的急慢性感染，共10例(男性7例，女性3例)，平均年龄(34.9±11.4)(18～55)岁。两组标本取材前已告知患者，签署知情同意书，并经我院伦理委员会审查备案(闽医大附一科研伦理审［2009］3号)。

1.2 主要试剂

TWEAK兔抗人多克隆抗体(Bioworld公司);Fn14兔抗人多克隆抗体(Abcam公司);抗兔二抗试剂盒(福建迈新生物技术开发有限公司);Trizol与反转录试剂盒(Invitrogen公司);PCR试剂盒(北京庄盟国际生物基因科技有限公司);PCR的TWEAK、Fn14及内参引物由上海生工生物技术公司设计合成(表1)。

表1 PCR引物序列Table 1 Primer sequence of PCR

1.3 方法

1.3.1 RT-PCR检测TWEAK和Fn14mRNA表达:取腰椎间盘髓核组织100 mg在液氮中磨碎，加1 mL Trizol彻底匀浆，经0.2 mL氯仿处理后离心，上清液用异丙醇沉淀，冰预冷DEPC处理水配制的75%乙醇1 mL洗涤沉淀物，弃乙醇，室温干燥后将沉淀溶于适量 DEPC水中，核酸紫外分析仪检测，计算RNA纯度与浓度，证实纯度达要求，用于后续实验。cDNA合成采用反转录试剂盒，将以下组分加入EP管中:1 μL oligo(dT)、2 μL 总 RNA、1 μL 10 mol/L dNTP、8 μL ddH2O;混合物在65 ℃加热5 min后，迅速置于冰上冷却。短暂离心后加入以下组分:4 μL第一链合成缓冲液、2 μL 0.1 mol/L DTT、1 μL RNaseOUTTM核酸酶抑制剂;在离心管中轻轻将各种成分混合，并在37℃下孵育2 min;室温下加入1 μL M-MLV反转录酶;37℃孵育50 min;70℃加热15 min以终止反应;马上进行PCR反应或－20℃保存。以RT反应产物(cDNA)为模板，扩增目的基因片段:建立25 μL的反应体系:2 μL cDNA，12.5 μL MasterMix，各1 μL TWEAK 和 GAPDH 上下游引物，6.5 μL ddH2O。PCR 反应条件:预处理 94℃5 min，58℃ 30 s、72℃ 60 s，30 次循环，72℃7 min。所得PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳。Fn14的扩增条件与TWEAK相同。

1.3.2 免疫组织化学SP法检测TWEAK和Fn14蛋白表达:免疫组化染色按SP法试剂盒说明书步骤进行，切片经脱蜡，微波热抗原修复，阻断内源性过氧化物酶，加入一抗多克隆兔抗人TWEAK(或Fn14)、二抗，DAB显色，苏木素复染，脱水后透明，中性树胶封片;空白对照采用PBS代替一抗。

1.4 结果判定

1.4.1 RT-PCR结果判定:采用1.2%琼脂糖凝胶，加入8 μL的PCR反应产物进行电泳，电压110 mV，22 min，紫外透射仪下观察并拍摄PCR特异性产物，通过PCR扩增片段条带位置与MarkerⅠ进行比较，判断扩增片段的正确性。计算机图像处理，测定各个条带的吸光度值，以目的基因与内参照的吸光度比值为半定量资料，进行统计分析。

1.4.2 免疫组化结果判定标准:TWEAK和Fn14主要为胞质表达，胞质着色呈棕黄色者为阳性细胞，淡黄色为弱阳性，不着色为阴性;切片用Ipp6.0软件测吸光度作图像分析。

1.5 统计学分析

数据用均值 ±标准差(±s)表示，应用SPSS13.0统计软件进行两样本均数t检验和简单相关分析。

2 结果

2.1 TWEAK和Fn14 mRNA在创伤及退变腰椎间盘中的表达

创伤及退变组椎间盘髓核组织均有TWEAK和Fn14mRNA的表达，退变组TWEAK和Fn14mRNA的表达明显高于创伤组(P＜0.01)(图1，2)。退变组TWEAK和Fn14的表达具有正相关性(P＜0.01)(图3)。

图1 创伤组及退变组TWEAK和Fn14 mRNA的表达Fig 1 Expression of TWEAK and Fn14 mRNA in the control group and the experimental group

图4 腰椎间盘髓核组织TWEAK和Fn14免疫组化染色Fig 4 Expression of TWEAK and Fn14 in different pulpy nucleus tissues of lumbar discs by immunohistochemistry staining(×400)

2.2 TWEAK和Fn14蛋白在创伤及退变腰椎间盘中的表达

TWEAK和Fn14蛋白在创伤组及退变组腰椎间盘中均有表达，退变组腰椎间盘中的表达明显高于创伤组腰椎间盘(P＜0.01)(图4，5)。退变组TWEAK和Fn14的表达具有正相关性(P＜0.01)(图3)。

3 讨论

图5 创伤组和退变组椎间盘髓核组织TWEAK和Fn14蛋白表达的比较Fig 5 Comparison of expression of TWEAK and Fn14 protein in pulpy nucleus tissues of lumbar disc in control group and experimental group

TWEAK是一种Ⅱ型膜蛋白，合成之初没有活性，经furin蛋白酶切割后分泌到细胞外，成为具有生物学活性的可溶性片段［7］。Fn14是一种Ⅰ型膜蛋白，为TWEAK的受体，其参与信号传导的机制尚未完全阐明。目前对Fnl4的研究表明，该受体本身不具有蛋白激酶活性，是通过接头分子(adaptor molecules)将其与下游信号传导分子联系起来。肿瘤坏死因子受体(tumor necrosis factor receptor，TNFR)相关因子家族(TNF receptor-associated factors，TRAF)是联系Fnl4和下游信号传导通路的一组重要接头分子［8］。当可溶性TWEAK作用于Fnl4阳性细胞株后，可通过 TRAF活化核转录因子(NF-κB)、细胞外信号调节激酶(extracellular signalregulated kinase，ERK)、p38丝裂原活化蛋白激酶(P38MAPK)和c-Jun氨基末端激酶(JNK)信号传导通路［9］。TWEAK是否还激活其他信号传导通路目前尚不明确。

椎间盘的退变与各种炎性反应介质有关，包括一氧化氮(nitric oxide，NO)、白细胞介素(interleukins，IL)、基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinases，MMP)、肿瘤坏死因子(tumor necrosis factor receptor，TNF)及其他细胞因子［10］。MMP-3 对椎间盘的破环作用至少包括两条途径:首先为直接降解椎间盘细胞外基质;其次，MMP-3在血管生成方面具有重要作用，而后者是腰椎间盘退变的重要特征［11］。TNF-α 和 IL-1β 可增加 MMP-3、MMP-13、促炎性反应酶类、诱导型一氧化氮合酶等促分解代谢蛋白酶的转录，而对Ⅱ型胶原、聚集蛋白聚糖、连接蛋白等基质蛋白的转录则明显抑制［12］。

本研究发现，在正常人腰椎间盘髓核组织中有TWEAK、Fn14mRNA和蛋白的表达，而在退变腰椎间盘髓核组织中的表达明显增加，而且TWEAK、Fn14mRNA和蛋白的表达呈现正相关性。提示TWEAK和Fn14是腰椎间盘退变的重要调节因子，TWEAK和Fn14的表达增加可能参与腰椎间盘退变的进程。有动物研究表明TWEAK通过阻断前体成骨和软骨细胞分化来阻止椎间盘的内源性修复。TWEAK和Fn14结合可诱导椎间盘细胞合成MMP-3。这种诱导作用可被TWEAK及Fn14的中和蛋白终止。也可被c-Jun氨基端激酶(JNK)抑制剂抑制，说明TWEAK和Fn14结合诱导MMP-3表达的信号传导通过JNK途径。TWEAK也可直接促进椎间盘外基质聚集蛋白聚糖的分解［13－14］。Huh等［15］取人椎间盘髓核培养研究，TWEAK 100 ng/mL即可明显降低了椎间盘髓核Sox9和聚集蛋白聚糖mRNA的表达水平，加入Fn14 500 ng/mL共培养，则Sox9和聚集蛋白聚糖mRNA的表达水平进一步下降。表明TWEAK即可与Fn14结合发挥作用，也可以其他的方式起作用。TWEAK和Fn14在人退变腰椎间盘髓核表达增加的原因和机制目前还不清楚，可能与负荷、损伤及各种细胞因子有关，有待进一步研究。

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Expression and significance of TWEAK and Fn14 in the degenerated and traumatic lumbar discs

CHEN Chun-yong1，SHEN Zheng-qing2，YE Jun-jian1*

(1.Dept．of Orthopaedics，the First Affiliated Hospital of Fujian Medical University，Fuzhou 350005;2.Dept．of Orthopaedics，Jinjiang Municipal Hospital of Fujian Province，Jinjiang 362200，China)

ObjectiveTo investigate the expression of TWEAK and Fn14 in nucleus pulposus of human degenerated lumbar discs and to evaluate the clinical significance．MethodsmRNA and protein expression of TWEAK and Fn14 in the experimental group(30 fresh pulpy nucleus of patients with lumbar disc herniation)and the control group(10 fresh pulpy nucleus of patients with traumatic lumbar vertebrae)were detected by semi-quantitative RTPCR and immunohistochemical staining．ResultsmRNA expression ofTWEAKwas significantly higher in the experimental group when compared with that of the control group(0.949±0.0931vs0.653±0.110，P＜0.01);It was same to TWEAK protein(0.682±0.126vs0.397±0.057，P＜0.01);Fn14mRNA(0.936±0.125vs0.632±0.059，P＜0.01);and Fn14 protein(0.540±0.051vs0.344±0.072，P＜0.01)．ConclusionsThe increased expression of TWEAK and Fn14 in degenerate lumbar discs indicates that TWEAK and Fn14 may be involved in the process of lumbar intervertebral disc degeneration(IDD)．

tumor necrosis factor-like weak inducer of apoptosis;fibroblast growth factor-inducible 14;intervertebral disc;intervertebral disc degeneration

R 681.5

A

1001-6325(2012)09-1053-06

2010－11－02

2011－12－09

福建省自然科学基金(C0710010);福建医科大学教授基金(JS09007)

*通信作者(corresponding author):yejunjian@medmail．com．cn