飞蝗两种群羧酸酯酶及谷胱甘肽S-转移酶活性与马拉硫磷敏感性关系的研究

马恩波，葛娉婷，张建琴，张建珍

（山西大学 应用生物学研究所，山西 太原 030006）

飞蝗两种群羧酸酯酶及谷胱甘肽S-转移酶活性与马拉硫磷敏感性关系的研究

马恩波，葛娉婷，张建琴，张建珍

（山西大学 应用生物学研究所，山西 太原 030006）

对飞蝗天津北大港种群及河北沧州种群进行了生物测定与生化水平的比较分析，生物测定结果显示，天津北大港种群对马拉硫磷的LD50值为河北沧州种群的13.2倍，显示天津北大港种群已对马拉硫磷产生了耐药性.两种群羧酸酯酶比活力分析表明，以α－醋酸萘酯（α-NA）为底物时，两种群羧酸酯酶比活力无显著差异;以α－丁酸萘酯（α-NB）和β－醋酸萘酯（β-NA）为底物时，飞蝗天津北大港种群较河北沧州种群羧酸酯酶比活力为低，且具有显著差异.以1氯-2，4-二硝基苯（CDNB）为底物对两种群谷胱甘肽S-转移酶活性进行检测，结果表明，河北沧州种群谷胱甘肽S-转移酶比活力高于天津北大港种群.以上结果显示，天津北大港种群对马拉硫磷的耐药性，可能与羧酸酯酶和谷胱甘肽S-转移酶没有直接的相关性，而与靶标敏感性的下降有关.

飞蝗;羧酸酯酶;谷胱甘肽S-转移酶;马拉硫磷

飞蝗（Locustamigratoria）主要以中生和半湿生性禾本科植物为食，如芦苇（Phragmitescommunis），稗草（Echinochloacrusgall），莎草（Cyperusrotundus）等，由于其暴发性和迁飞性特点，对农业生产构成严重威胁［1］.自1983年Georghiou等［2］报道昆虫对DDT产生抗性以来，已发现多种农林害虫对常用化学农药产生了抗药性，如：小菜蛾（Plutellaxylostella），库蚊（Culex），桃蚜（Myzuspersicae）等.本课题组曾报道东亚飞蝗已对马拉硫磷产生了一定程度的抗药性，害虫产生抗药性与体内代谢酶系的解毒能力增强和靶标酶不敏感性有关［3］.

已有学者开展了昆虫羧酸酯酶和谷胱甘肽S-转移酶生化方面的研究，孙鲁娟等［4］比较了不同底物作用下室内培养的抗乐果棉蚜品系与敏感品系酯酶比活力，发现以α-NA和α-NB作底物时，抗性品系棉蚜的比活力显著低于敏感品系，Taskin等［5］研究了家蝇（Muscadomestica）马拉硫磷特异性羧酸酯酶 MCE的活性，发现马拉硫磷抗性品系中的 MCE活性明显高于敏感品系.Leeuwen等［6］测定了田间多抗二斑叶螨（Tetranychusurticae）酯酶活性，发现抗性种群中的酶活性较敏感品系为高.Achaleke等［7］发现抗拟除虫菊酯的棉铃虫酯酶活性高于敏感品系.本课题组前期研究表明，东亚飞蝗河北黄骅田间种群对马拉硫磷产生抗药性由多种机制造成，包括酯酶和谷胱甘肽S-转移酶解毒能力的增强和乙酰胆碱酯酶敏感性的下降［8－10］.郭丽等［11］测定不同浓度敌敌畏作用下德国小蠊谷胱甘肽S-转移酶的活性，结果显示随着施药浓度增加谷胱甘肽S-转移酶活性逐渐降低，认为谷胱甘肽S-转移酶是敌敌畏的重要代谢酶.宣涛等［12］从东亚飞蝗5龄若虫中分离纯化出24 k Da的谷胱甘肽S-转移酶，并对其基本特性进行了分析，同年又对东亚飞蝗不同龄期解毒酶和靶标酶活性做了研究［13］.

本文采用生物测定及羧酸酯酶和谷胱甘肽S-转移酶酶活性检测方法对飞蝗天津北大港种群和河北沧州种群进行有机磷农药耐药性水平的检测及羧酸酯酶和谷胱甘肽S-转移酶生化机制的初步探讨，为蝗虫治理提供一定的理论依据.

1 材料与方法

1.1 供试材料

飞蝗河北沧州种群蝗卵由河北沧州蝗虫饲养公司提供，天津北大港种群于2009年6月采自天津北大港，并在室内饲养一代作为实验材料.两种群均在25 cm×25 cm×25 cm规格的铁纱笼中饲养，用新鲜麦苗饲喂，每天换1－2次小麦，选取活力旺盛的若虫作为实验材料.

1.2 飞蝗生物测定

采用点滴法测定飞蝗对马拉硫磷的敏感性，用丙酮将马拉硫磷原药稀释成5个适当的浓度（河北沧州种群：0.3、0.15、0.05、0.025、0.012 5 mg／m L.天津北大港种群：3.2、1.6、0.8、0.4、0.2 mg／m L），用微量移液器取3μL稀释农药点滴于2龄飞蝗若虫第2－3腹节之间，每个浓度点滴17－19头，雌雄各半，河北沧州种群每组2个生物学重复，天津北大港种群每组3个生物学重复，对照组均点滴3μL丙酮.室温饲养24 h后观察死亡情况，轻触虫体不动为死亡.记录各个浓度的试虫数和死亡数.用SPSS统计程序进行回归分析，求出飞蝗对有机磷的LD50值.

1.3 酶活性测定

1.3.1 粗酶液提取

测定飞蝗两种群羧酸酯酶（Car Es）和谷胱甘肽S-转移酶（GSTs）活性，河北沧州种群选取活力旺盛的5龄飞蝗20头，雌雄各半.天津北大港种群选取30头，雌雄各半.取其胸部，单头匀浆.

1.3.2 羧酸酯酶活性测定

分别以α-NA、β-NA和α-NB为底物测定羧酸酯酶活性，步骤同文献［14］测定羧酸酯酶活性的方法.

1.3.3 羧酸酯酶动力学常数Km、Vmax值的测定

以α-NA、α-NB和β-NA为底物测定羧酸酯酶动力学常数，采用0.1 mol·L－1、p H 7.5的磷酸缓冲液以2倍梯度稀释底物，使底物在反应体系中的终浓度依次为0.006 25、0.012 5、0.025、0.05、0.1、0.2和0.4 mmol·L－1，其它操作步骤及酶活力计算方法同1.3.2.采用 Hanes plot方法［15］计算Km和Vmax值.

1.3.4 谷胱甘肽S-转移酶活性测定

以CDNB为底物测定谷胱甘肽S-转移酶活性，具体操作步骤同Yang等［16］的测定方法.

1.4 蛋白质含量的测定

蛋白质含量测定方法同Smith等［17］的方法，用牛血清白蛋白BCA作为标品，560 nm处读取OD值.

2 结果

2.1 两种群对马拉硫磷敏感性的比较

飞蝗天津北大港种群及河北沧州种群对马拉硫磷的LD50值分别为48.15和3.66μg／g虫重.天津北大港种群比河北沧州种群对马拉硫磷的敏感性降低了13.2倍（表1，P385）.

2.2 两种群羧酸酯酶活性和动力学比较

对飞蝗两种群进行羧酸酯酶活性检测，结果表明，以α-NA为底物时，飞蝗河北沧州种群和天津北大港种群羧酸酯酶比活力没有显著差异（P＞0.05）.以α-NB和β-NA为底物时，河北沧州种群羧酸酯酶比活力高于天津北大港种群，分别为1.29和1.37倍，且有显著差异（P＜0.05），如图1-A（P385）所示.

两种群羧酸酯酶动力学研究表明，飞蝗河北沧州种群和天津北大港种群的羧酸酯酶对α-NA、α-NB和β－NA 3个底物均具有水解活性，其相应的Km和Vmax值在两种群中均无显著差异（P＞0.05），如表2（P385）所示.但同一种群内，与3个底物的Km值相比，以α-NA为底物时Km最小，表明飞蝗羧酸酯酶的最适底物是α-NA.以α-NA为底物时，天津北大港种群的Km和Vmax值分别是河北沧州种群的0.99和0.77倍;以α-NB为底物时，天津北大港种群的Km和Vmax值分别是河北沧州种群的1.37和0.83倍.以β-NA为底物时，天津北大港种群的Km和Vmax值分别是河北沧州种群的1.41和0.88倍.

表1 两种群对马拉硫磷敏感性的比较Table 1 Comparison of malathion susceptibility of Locustamigratoria from two populations

图1 两种群羧酸酯酶和谷胱甘肽S-转移酶比活性的比较Fig.1 Comparisons of specific activities of Car Es and GSTs in two populations of L.migratoria

表2 两种群羧酸酯酶动力学比较aTable 2 Kinetic parameters of Car Es in two populations

2.3 两种群谷胱甘肽S-转移酶活性的比较

对飞蝗两种群进行谷胱甘肽S-转移酶活性检测，结果表明，以CDNB为底物时，飞蝗河北沧州种群谷胱甘肽S-转移酶比活力高于天津北大港种群，为1.18倍，且有差异显著（P＜0.05，图1-B）.

3 讨论

天津北大港是我国重要的沿海及滨湖蝗区，飞蝗连年发生，化学农药防治频繁.为检测这一田间种群对杀虫剂是否产生耐药性，研究羧酸酯酶和谷胱甘肽S-转移酶在有机磷杀虫剂耐药性产生中的功能作用，本课题组于2009年6月进行了田间飞蝗采集，并开展了一系列生化与分子水平的研究.马拉硫磷生物测定结果显示飞蝗天津北大港种群比河北沧州种群对马拉硫磷的敏感性降低了13.2倍.马拉硫磷的选择压力是引起这两个种群对马拉硫磷敏感性差异的主要原因.对于河北沧州种群，该蝗虫饲养公司采用大棚内养殖飞蝗，农药选择压力小;而天津北大港种群化学农药喷洒频繁，因而该种群对马拉硫磷的敏感性较河北沧州种群为低.

羧酸酯酶和谷胱甘肽S-转移酶是昆虫产生代谢抗性的重要酶系.羧酸酯酶是酯酶的一大类家族酶，酯酶在昆虫体内的解毒机制主要是将包含酯键的内源性和外源性化合物分解为相应的醇和酸［18］.目前使用的大多数杀虫剂均属于酯类化合物，因此酯酶在昆虫降解杀虫剂方面扮演着重要的角色［19］.GSTs是生物体内的一类Ⅱ相代谢酶，能使有害的亲电物质与内源的还原型谷胱甘肽（GSH）结合，使之更易于排出体外［12，20］.GSTs主要介导有机磷、拟除虫菊酯和DDT等的抗性，已有研究显示昆虫杀虫剂抗性水平与GSTs活性水平相关［12－13，20－21］.

羧酸酯酶比活力研究结果显示以α-NA为底物时，两种群羧酸酯酶比活力没有显著差异（P＞0.05），以α-NB和β-NA为底物时，飞蝗天津北大港种群较河北沧州种群羧酸酯酶比活力为低，且有显著差异（P＜0.05）.分析认为该种群对马拉硫磷的耐药性可能与羧酸酯酶活性没有直接的相关性.表2结果显示：两种群α-NA、α-NB和β-NA的羧酸酯酶动力学参数Km值均没有显著差异（P＞0.05）.表明羧酸酯酶可能没有在影响酶活性的关键位点发生突变.本实验室采用Real-time PCR方法检测飞蝗羧酸酯酶基因在河北沧州种群和天津北大港种群m RNA的差异表达，结果显示25个羧酸酯酶基因在两种群中均没有显著差异（数据未列出），表明羧酸酯酶不同家族基因间mRNA相对表达量也没有发生明显改变.分析认为，两种群对马拉硫磷的敏感性差异可能与羧酸酯酶没有直接的相关性.

以CDNB为底物对飞蝗两种群谷胱甘肽S-转移酶活性进行检测，结果显示飞蝗河北沧州种群谷胱甘肽S-转移酶比活力比天津北大港种群酶活性为高.贾苗等［22］对9个谷胱甘肽S-转移酶基因的mRNA水平表达分析也显示河北沧州种群高于天津北大港种群，表明两种群对马拉硫磷的敏感性差异可能与谷胱甘肽S-转移酶也没有直接的相关性.

根据以上研究结果推测两种群对马拉硫磷的敏感性差异很可能与靶标敏感性下降有关.李飞等［23］发现乙酰胆碱酯酶活性在抗性棉蚜品系中显著下降，表明棉蚜抗性品系体内代谢抗性和靶标抗性同时存在，不同抗性水平二者所起的作用不同.郭丽等［11］的研究表明敌敌畏对德国小蠊乙酰胆碱酯酶有抑制作用，即乙酰胆碱酯酶的敏感性下降对敌敌畏产生抗性.吴海花等［24］的研究也表明中华稻蝗对马拉硫磷的敏感性可能与乙酰胆碱酯酶的不敏感性有关.本文所研究的天津北大港种群对马拉硫磷的耐药性机制还有待于更进一步的验证.综上所述，飞蝗对马拉硫磷产生耐药性是多种因素作用的结果，因此，对飞蝗耐药性机制应进行全面的研究.

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Activities of Carboxylesterases and GlutathioneS-transferases Related to Malathion Susceptibility in two Populations ofLocustamigratoria

MA En-bo，GE Ping-ting，ZHANG Jian-qin，ZHANG Jian-zhen
（InstituteofAppliedBiology，ShanxiUniversity，Taiyuan030006，China）

A series of comparative analysis including bioassay，biochemical studies to the locust collected from Tianjin beidagang and Hebei cangzhou were conducted.The bioassay indicated that Tianjin Beidagang population was tolerance to malathion（tolerance ratio＝13.2）.The carboxylesterases（Car Es）specific activity withα-naphthyl butyrate（α-NB）andβ-naphthyl acetate（β-NA）substrates of the Hebei Cangzhou population was significantly higher compared with Tianjin Beidagang population.While theα-naphthyl acetate（α-NA）was used as substrate，the significant difference of Car Es specific activity between two populations was not detected.The specific activity of glutathioneS-transferases（GSTs）of Hebei Cangzhou population was significantly higher than these of Tianjin Beidagang population when 1-chloro-2，4-dinitrobenzene（CDNB）was used as substrate.All these results suggested that the observed tolerance to malathion in the Tianjin Beidagang population was not conferred by the Car Es and GSTs，but possibly related to the reduction of the target sensitivity.

Locustamigratoria;Carboxylesterase;GlutathioneS-transferases;malathion

Q965

A

2011-11- 26;

2011-12-29

国家自然科学基金重大国际合作项目（30810103907）;国家自然科学基金（30870302）;山西省自然科学基金（2011011033-1）;公益性农业科研项目（200903021）

马恩波（1953－），女，山西交城人，博士，教授，主要研究方向为动物生化与分子生物学.E-mail：maenbo2003＠sxu.edu.cn