卫星灵芝液体发酵富集硒锌的研究

杨泽涛，李莉，陈超，修翠娟

(辽宁省微生物科学研究院，辽宁朝阳122000)

灵芝素有“仙草”、“瑞草”之称，它因有滋补强壮、扶正固本、延年益寿等独特功效而驰名中外。现代科学分析表明，灵芝的营养丰富且医食价值高，它含有人体必须的氨基酸、脂肪酸、微量元素、胡萝卜素及生物活性多糖等。药食用真菌富含多糖，灵芝多糖具有多种生理功能，如抗衰老，防治癌症等，能提高机体免疫力和耐氧能力，清除自由基，抑制肿瘤，抗辐射，提高肝脏、骨髓血液合成DNA、RNA和蛋白质的能力［1-4］。硒、锌是人体必需的微量元素，硒是谷胱甘肽过氧化物酶的组成成分，具有保护细胞膜和血红蛋白免受氧化的作用。研究证实人类的克山病、大骨节病、冠心病、糖尿病、癌症等多种疾病都与缺硒有关。锌是多种酶、蛋白质和核酸的重要组成部分，参与人体基因的复制、蛋白质的生物合成、激素与受体的特异结合，能促进生长发育与组织再生，提高动物体的生理和代谢功能及免疫作用。人体缺乏锌会食欲不振、生长迟缓、免疫力下降、生殖机能受损等［5-9］。本文以灵芝为载体，采用深层发酵的方法生物富集硒、锌，通过生物转换作用将无机硒、锌转化为生物活性硒、锌，提高灵芝的利用价值，为药食用真菌富集微量元素的研究提供理论参考。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 供试菌种卫星灵芝2号菌株，由辽宁省微生物科学研究院菌种中心提供，是1996年经我国“961020”返地式卫星搭载后筛选出的太空诱变菌株。

1.1.2 原料玉米粉、黄豆粉、麸皮均为市售。

1.1.3 培养基①母种PDA综合培养基(g/100 mL):去皮马铃薯20，葡萄糖2，KH2PO40.3，MgSO4·7H2O 0.15，酵母膏0.3，琼脂2，维生素B11片/L，pH自然，蒸馏水配制;②液体种子培养基(g/100 mL):玉米面1.5，葡萄糖1，酵母膏0.3，KH2PO40.1，MgSO4·7H2O 0.05，维生素B11片/L，pH自然，蒸馏水配制;③发酵培养基(g/100 mL):玉米粉3，葡萄糖3，酵母膏0.3，KH2PO40.1，MgSO4·7H2O 0.05，维生素B11片/L，pH 6.0，蒸馏水配制。

1.1.4 化学试剂葡萄糖、蛋白胨、MgSO4、KH2PO4、维生素B1、酵母膏、Na2SeO3、ZnSO4。

1.1.5 主要仪器回旋式恒温调速摇瓶柜，医用电热恒温培养箱，电热恒温干燥箱，超净工作台，原子吸收分光光度计，AFS-830a双道原子荧光光度计。

1.2 方法

1.2.1 分析方法①生物量测量方法:发酵液经4 000 r/min离心15 min后收集菌丝体，用蒸馏水冲洗2～3次，70℃烘干至恒重，称重;②锌、硒含量测定:采用火焰原子吸收分光光度计及AFS-830a双道原子荧光光度计进行测定;③锌、硒富集率的计算方法:锌、硒富集率(%)=(菌丝体产率(%)×(菌丝体中锌、硒含量mg/kg－分子量))/(1 000×10)×100。

1.2.2 菌种活化将卫星灵芝斜面菌种接入PDA综合培养基中，于27℃恒温培养4～5 d，活化2～3代后备用。

1.2.3 菌种驯化以ZnSO4、Na2SeO3为供体，将活化后的卫星灵芝菌株，用打孔器打取直径为0.5 cm的菌块，分别接种于含有不同浓度的硒或锌的PDA培养基上，28℃恒温培养5 d，测量其菌落直径，对比不同添加浓度下的PDA平板上菌丝体生长情况。同时以未加硒或锌元素的培养基做空白对照。

1.2.4 灵芝富集硒、锌方法①单元素富集实验:挑取驯化后发育良好的菌丝块(直径1.0 cm)于种子培养基中进行二次驯化培养。按规定10%(体积比)接种量分别接入含有不同浓度硒、锌的液体发酵培养基中，180 r/min、29℃恒温培养46 h，按照1.2.1方法测定菌丝体干重、菌丝体中硒、锌的含量及转化率，确定锌。以未加锌、硒的培养基做空白对照;②二元素同步富集实验:同上操作，将驯化培养的种子培养液接种于同时含有一定浓度硒和锌的发酵培养基中，按上述条件培养，测定菌丝体干重;称取一定量的菌丝体粉，用透析法去除菌丝体中游离的硒和锌，按照1.2.1方法测定透析前后的菌丝体中硒、锌的含量，考察液体发酵同步富集2种元素有机化程度。

2 结果与分析

2.1 驯化试验

2.1.1 不同亚硒酸钠浓度对菌落形态影响分别以含亚硒酸钠浓度为20、40、60、80、100、120、150、200、500 mg/L的PDA平板对试验菌株进行驯化实验。结果表明(表1):在试验范围内不同浓度的硒离子对平板上菌丝体的生长均具有不同程度的抑制作用，随着浓度的增加抑制作用逐渐增强，致死浓度为500 mg/L。当培养基中亚硒酸钠的浓度为80 mg/L时菌丝体长势最好，菌丝体密集性强，驯化后的灵芝菌丝较对照短粗、形态浓密，菌丝洁白。

2.1.2 不同锌浓度对菌落形态的影响分别以含硫酸锌浓度为20、40、60、80、100、150、200、250、300、350、400、500 mg/L的PDA平板对卫星灵芝菌株进行驯化实验。结果表明(表2):实验范围内培养基中适宜浓度的锌离子对灵芝菌丝的生长具有明显促生长作用，灵芝菌落直径随锌浓度的增加而增大，当锌浓度达到150 mg/L时，菌落直径达到最大，驯化效果也最好;驯化后的灵芝菌丝体较对照组洁白、粗壮、密集性强，菌丝较长。而后随着锌浓度的增加菌落直径逐渐减小，促生长效果降低，锌浓度大于300 mg/L时，对灵芝菌丝体生长具有明显的抑制作用，锌浓度500 mg/L时培养基凝固效果不好，灵芝菌丝体无法生长。

表1 不同浓度亚硒酸钠驯化培养基中菌丝体的生长情况Table 1 Mycelial growth in taming medium with different sodium selenite concentration

表2 不同浓度硫酸锌驯化培养基中菌丝体的生长情况Table 2 Mycelial growth in taming medium with different zinc sulfate concentration

2.2 亚硒酸钠浓度对菌丝体生长和富集硒效果的影响

分别在液体发酵培养基中添加20、40、60、80、100 mg/L的亚硒酸钠，接种驯化后的液体菌种进行摇瓶发酵。结果表明(表3):当发酵培养基中添加不同浓度的硒时，对菌丝体生长均具有不同程度的抑制作用，生物量明显低于对照组，但灵芝菌丝体的富硒量随着硒浓度的增加而提高，但当硒的浓度超过40 mg/L时，菌丝体生物量、富硒量最高，富集效果最好。

表3 硒浓度对灵芝菌丝体生长及富集的影响Table 3 Effect of selenium concentration on SGL mycelial growth and enrichment

2.3 锌浓度对菌丝体生长和富集锌效果的影响

分别在液体发酵培养基中添加20、40、60、80、100、150、200 mg/L的硫酸锌，接种驯化后的液体菌种进行摇瓶发酵。由表4可以看出:当培养基中锌浓度低于150 mg/L的范围内对菌丝体生长有明显的促进作用，生物量明显高于对照组，而菌丝体中的锌含量随着锌浓度的增加而增加，当培养基中的锌浓度为60 mg/L，菌丝体中的锌含量和富锌转化率最高。

表4 锌浓度对灵芝菌丝体生长及富集的影响Table 4 Effect of zinc concentration on SGL mycelial growth and enrichment

2.4 液体培养同步富集锌、硒实验

在液体发酵培养基中添加40 mg/L的亚硒酸钠和60 mg/L的硫酸锌，接种驯化后的液体菌种进行摇瓶发酵，初步考察了灵芝液体发酵生产菌丝体中锌、硒的含量及转化率，同时采用透析的方法对菌丝体中锌、硒的结合状态进行了分析，见表5。初步的结果表明:当培养基中同时添加不同浓度的锌和硒时，与单元素富集实验相比，菌丝体中硒、锌的含量及富集转化率均较低;透析后灵芝菌丝体对锌的富集效率与硒相比，富集效率较低，透析前后的菌丝体中硒的含量和富集率变化不大，说明灵芝菌丝体对无机硒的聚集主要是以有机硒的方式富集;而对无机锌的富集结合状态有无机和有机2种形式并存。

表5 液体深层发酵灵芝菌丝体同步富集锌、硒的效应Table 5 Simultaneous enrichment effect of zinc and selenium in SGL mycelium in liquid submerged fermentation

3 讨论

灵芝菌种经过无机锌的驯化后，菌落形态明显优于对照组和无机硒实验组，菌落边缘整齐，菌丝长而粗壮、致密，色泽洁白，适当浓度范围的无机锌对灵芝菌丝体的促生长作用非常明显，这主要缘于锌与酶的关系极为密切，它决定并影响着160多种酶的活性，尤其对金属酶具有催化性、结构性和调节性功能。这些酶类主要包括氧化还原酶(超氧化物歧化酶)、转移酶(RNA聚合酶)、水解酶(碱性磷酸酶)、裂解酶(碳酸酐酶)及连接酶(tRNA合成酶)。锌还是许多功能蛋白如金属硫蛋白、核蛋白、受体等的组成成分，可直接参与核酸及蛋白质合成，对细胞的分裂生长及再生作用重大。而无机硒在灵芝所能忍耐的硒浓度范围内，低浓度的硒对灵芝菌丝生长影响比较小，随着硒浓度的增加抑制作用明显增强，甚至引起毒害。

卫星灵芝菌丝体具较强的富集硒、锌的能力，液体深层发酵灵芝富硒菌丝体的最佳亚硒酸钠浓度为40 mg/L，菌丝体生长量1.54%，富硒量2 131.5 mg/kg，富硒率32.91%。最佳硫酸锌浓度为60 mg/L，菌丝体生长量1.76%，富锌量为1 142.91 mg/kg，富锌率为16.84%。培养基中同时添加40 mg/L亚硒酸钠和60 mg/L硫酸锌，透析前富硒量301.85 mg/kg，富硒率4.84%;富锌量为540.41 mg/kg，富锌率为5.72%;透析后富硒量295.86 mg/kg，富硒率4.75%;富锌量为355.26 mg/kg，富锌率为2.76%。

同步富集与单元素富集结果相比，灵芝菌丝体中的2种离子的含量及富集转化率均较低，这是由于灵芝对锌、硒的赋存形态主要是与灵芝蛋白组分相互结合，2种离子存在结合位点的竞争关系，所以富集结果明显低于单元素富集效应。另外，在同步富集实验中，卫星灵芝富集硒元素的有机化程度较锌元素高，透析前后的富硒率变化不大，这可能是由于2种离子在卫星灵芝菌丝体中结合形式和参与代谢方式有关，如何提高同步富集硒、锌的含量还有待于进一步的实验研究。

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