白藜芦醇抑制膀胱癌细胞生长增殖及影响miR－34a表达的研究

王 伟，李 覃，李 瑛，李 辉

白藜芦醇抑制膀胱癌细胞生长增殖及影响miR－34a表达的研究

王 伟1，李 覃2，李 瑛1，李 辉1

目的观察白藜芦醇(resveratrol，Res)对人膀胱癌细胞T24生长增殖的影响，初步探讨miR－34a在Res影响T24细胞中的作用。方法不同浓度Res分别作用T24细胞24 h，采用甲基噻唑基四唑(methyl thiazolyl tetrazolium，MTT)法检测细胞增殖，流式细胞术检测细胞凋亡，Western blotting检测p53蛋白水平，实时定量PCR(Real－time PCR)检测T24细胞miR－34a的基因表达。结果Res剂量依赖性地抑制T24细胞增殖，诱导细胞凋亡，明显增加p53的蛋白表达。此外，Res处理后T24细胞中miR－34a的基因表达亦显著升高。结论Res能够有效抑制膀胱癌细胞生长增殖，可能与诱导细胞凋亡、上调miR－34a及p53表达有关。

白藜芦醇;膀胱癌;细胞凋亡;miR－34a;p53

白藜芦醇(resveratrol，Res)是非黄酮类多酚化合物，具有抗肿瘤、抗感染、抑制血小板聚集、调节脂质代谢等多种生物学活性［1］。自从 Jung等［2］首次在Science杂志对Res在肿瘤发生、发展各阶段的抑制作用进行了系统报道之后，Res便成为肿瘤防治领域的研究热点，并被认为是最具有希望的天然化学防癌剂之一，但其具体作用机制因细胞种类不同而异［3］。

微小RNA(MicroRNA，miRNA)是一类由基因组编码的单链小分子RNA。新近研究显示，miRNA的表达水平在人类膀胱癌组织与正常膀胱组织间具有明显差异，与膀胱癌的生物学特性存在密切关系，有望成为膀胱癌生物治疗的新靶点［4］。本研究选用人膀胱癌T24细胞作为研究对象，通过观察Res对T24细胞增殖和细胞凋亡的影响，初步探讨miRNA－34a在其中的作用。

1 材料与方法

1.1 材料 人膀胱癌T24细胞株由天津医科大学泌尿研究所惠赠，Res(纯度99.12%)购于陕西赛德生物股份有限公司，RPMI1640、胎牛血清(FCS)购自Gibco公司，二甲基亚砜(DMSO)、MTT购自Sigma公司，Annexin V－PI Staining试剂盒购于BD公司，Real－time PCR相关试剂购自Promega公司。

1.2 试剂配制 Res溶于DMSO成1 mmol/L，滤过除菌，－20℃贮存。体外实验时以RPMI 1640细胞培养液稀释至所需浓度(DMSO终浓度不高于0.1%)。

1.3 细胞培养及增殖分析 取对数生长期膀胱癌T24 细胞，以 6.25、12.5、25、50、100 μmol/L Res 分别作用24 h。另设不加Res的T24细胞为对照组，同时设不含细胞和不做任何处理的空白对照消除背景干扰，每组设3个复孔。加入5 mg/ml MTT 20 μl，再培养4 h，离心 1000 r/min，5 min 后小心吸去上清，加入DMSO溶解沉淀，490 nm处测定光吸收度(A值)，计数细胞生长抑制率及半数抑制浓度(IC50)。

1.4 Annexin－V法检测细胞凋亡 以终浓度为100 μmol/L的Res处理T24细胞24 h，按照试剂盒说明分别用FITC标记的Annexin－V和PI染色细胞，在流式细胞仪(FACSCalibur)上分析荧光强度，定量检测各组细胞凋亡情况。

1.5 Western blot 以100 μmol/L Res作用 T24细胞24 h，裂解细胞后经Bio－Rad法进行蛋白定量，12%SDS－PAGE凝胶电泳，半干法转至PVDF膜，一抗为 p53(1∶1000)，以 β －actin(1∶1000)作为内参照。ECL法检测，采用BioRad系统进行数据处理。

1.6 Real－time PCR 首先根据miRNA的结构特点，设计茎环结构的反转录引物。提取总RNA，按试剂盒说明进行反转录，在BioRad CFX96定量PCR仪上进行定量检测。PCR条件为94℃ 2 min，94℃15 s，60℃ 1 min，进行40个循环;采用U6 RNA作为内标。样品目的基因的相对表达率(RQ)采用△△CT方法计算，RQ=2－△△CT，以未处理的 T24细胞作为相对表达的标准。

1.7 统计学处理 所有数据使用SPSS13.0统计软件，采用多因素重复测量数据的方差分析或单因素方差分析进行组间比较，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 Res抑制膀胱癌T24细胞生长增殖 对照组T24细胞增殖明显，Res处理组对T24细胞的增殖抑制作用呈一定的剂量依赖性，其中6.25、12.5、25、50、100 μmol/L 浓度的抑制率分别为(21.25 ±3.67)%、(25.89±6.26)%、(38.17±2.25)%、(43.28±4.34)%、(53.26±4.52)%，与 6.25 μmol/L 组比较，25、50、100 μmol/L 组的抑制率差异有统计学意义(P＜0.01)。24 h的 IC50为(85.68± 4.62)μmol/L。

2.2 Res诱导膀胱癌T24细胞凋亡 流式细胞检测结果显示，100 μmol/L Res作用 24 h后可见(39.26±6.86)%的T24细胞发生凋亡，说明Res能够以诱导膀胱癌细胞凋亡的方式杀伤T24细胞。

2.3 Res对T24细胞p53蛋白表达的影响 Western blot检测结果可见，Res能够明显增加p53蛋白的表达水平(图1)。

图1 白藜芦醇影响p53的蛋白表达

2.4 Res上调miR－34a的基因表达 Real－time PCR检测发现，Res处理组和未处理组均有miR－34a和U6的特异性条带，miR－34a与U6均显示出可靠的CT值。100 μmol/L Res作用24 h后miR－34a表达明显升高，是未处理组的4.1倍。

3 讨 论

膀胱肿瘤是我国最常见的泌尿系恶性肿瘤，局部治疗后容易复发，且缺乏理想的肿瘤标记物［5］。目前常用的化疗药物对膀胱肿瘤细胞杀伤作用缺乏靶向性，且不良反应大。研究表明，有600多种中草药具有不同程度的杀伤癌细胞的作用，由于不良反应小，能增强机体免疫力，降低化疗不良反应，减少复发等特点而备受各国研究人员的关注。Res作为传统中药虎杖的主要有效成分，基本不造成器官和功能损害，在肿瘤的化学治疗和化学预防方面具有良好的应用前景［6］。尽管对Res的抗肿瘤研究已经取得许多进展，但是目前对Res影响膀胱癌的具体作用机制和干预靶点尚未完全阐明。本实验观察到，膀胱癌细胞经不同浓度Res作用后，生长增殖明显受抑，细胞凋亡增加，说明Res能够有效抑制膀胱癌细胞，其作用机制可能与诱导细胞凋亡有关。

p53蛋白在DNA损伤后表达，可启动修复机制，如修复失败或发生广泛DNA损伤，则P53激活凋亡通路。现已证实，p53突变是评估膀胱癌发生的重要机制，在高分期、分级的膀胱癌中频繁表达，在膀胱癌的进展、预后及治疗中都起着非常重要的作用。笔者研究发现，Res处理后，膀胱癌T24细胞p53蛋白表达显著增加，提示上调p53可能是Res诱导细胞凋亡所致DNA损伤的继发性改变，进而增强Res的促凋亡效应。

miRNA在肿瘤的增殖、分化和凋亡等生物过程中发挥重要作用，其中miR－34家族(主要包括miR－34a，miR－34b和miR－34c)与肿瘤细胞凋亡关系密切，能够诱发Caspase调控的凋亡途径［7］;或通过抑制 Bcl－ 2 促进细胞凋亡［8］。此外，亦有研究表明，p53可作为miR－34a发挥作用的始动基因，miR－34a缺失的胰腺癌患者p53抗肿瘤作用受影响［9］。Hermeking 等［10］进一步研究指出，端粒酶的氧化应激和癌基因的活化等因素可导致DNA损伤，进而活化p53，再级联激活miR－34，与Bcl－2等形成复合物，抑制或降解下游基因的表达［11］。本研究显示，Res干预组 T24细胞miR－34a的表达是对照组的4.1倍，由此推测Res可能通过促进miR－34a表达诱导膀胱癌T24细胞凋亡，但其与miR－34a之间的确切交互关系尚需进一步深入研究。

总之，本研究初步探讨了Res对膀胱癌T24细胞的影响及miR－34a在其中的作用，可为膀胱癌在基因水平上的干预治疗及研制新型防治药物提供理论和实验依据。

［1］Bhat K L，Kosmeder J W，Pezzuto J M.Biological effects of resveratrol［J］.Antioxid Redox Signal，2001，3(6):1041－1064.

［2］Jang M，Cai L，Udeani G O，et al.Cancer chemopreventive activity of resveratrol，a natural product derived from grapes［J］.Science，1997;275(5297):218 －220.

［3］He X，Wang Y，Zhu J H，et al.Resveratrol enhances the anti－tumor activity of the mTOR inhibitor rapamycin in multiple breast cancer cell lines mainly by suppressing rapamycin － induced AKT signaling［J］.Cancer Lett，2011，301(2):168－176.

［4］Passetti F，Ferreira C G，Costa F F.The impact of microRNAs and alternative splicing in pharmacogenomics［J］.Pharmacogenomics J，2009，9(1):1 －13.

［5］韩 宇，洪宝发，钟定荣，等.联合表达人端粒酶反转录酶hTERT及VEGF与肿瘤复发的关系［J］.武警医学，2008，19(2):105－108.

［6］Kaindl U，Eyberg I，Rohr－Udilova N，et al.The dietary antioxidants resveratrol and quercetin protect cells from exogenous pro － oxidative damage［J］.Food Chem Toxicol，2008，46(4):1320 －1326.

［7］Rokhlin O W，Scheinker V S，Taghiyev A F，et al.MicroRNA－34 mediates AR－dependent p53－induced apoptosis in prostate cancer ［J］.Cancer Biol Ther，2008，7(8):1288－1296.

［8］Welch C，Chen Y，Stallings R L.MicroRNA －34a functions as a potential tumor suppressor by inducing apoptosis in neuroblastoma cells［J］.Oncogene，2007，26(34):5017－5022.

［9］Chang T C，Wentzel E A，Kent O A.Transactivation of miR－34a by p53 broadly influences gene expression and promotes apoptosis［J］.Mol Cell，2007，26(5):745－752.

［10］Hermeking H.p53 enters the microRNA world ［J］.Cancer Cell，2007，12(5):414 －418.

［11］Hermeking H.The miR －34 family in cancer and apoptosis［J］.Cell Death Differ，2010，17(2):193 －199.

A study of resveratrol to suppress proliferation of human bladder cancer cell line T24 and to affect expression of miR－34a

WANG Wei1，LI Tan2，LI Ying1，and LI Hui1.1.Department of Nephrology，The Affiliated Hospital of Logistics Institute of the Chinese People’s Armed Police Forces，Tianjin 300162;2.Department of Immunology，Logistics Institute of the Chinese People’s Armed Police Forces，Tianjin 300162，China

ObjectiveTo investigate the effects of resveratrol on proliferation of human bladder cancer cell line T24，and the role of miR－34a in its mechanism.Methods T24 cells were treated with resveratrol in different concentrations for 24 h.Cell proliferation was validated by MTT.Flow cytometry was used to analyse apoptosis.The expression of miR －34a was detect by real－time PCR.Results Resveratrol could inhibit the proliferation of T24 in a dose dependent manner，induce apoptosis and increase the expression of p53 significantly.Furthermore，the level of miR －34a in T24 cells was higher in resveratrol－treated group than that in the control group.Conclusions Resveratrol can suppress the proliferation of human bladder cancer cells，which may be attributed to inducing apoptosis，up－regulating miR －34a and p53.

resveratrol;bladder cancer;apoptosis;miR－34a;p53

R737.14

武警后勤学院附属医院种子基金面上项目(FYM201211)，武警后勤学院科研基金面上项目(WYM201016)

王 伟，男，1976年出生。硕士，副主任医师。主要从事泌尿系统的基础与临床研究。

300162 天津，武警后勤学院:1.附属医院肾病科;2.免疫学教研室

李 辉，E－mail:wjliyisheng99@sina.com

(2012－05－19收稿 2012－08－11修回)

(责任编辑 尤伟杰)