玻璃化法优化保存川贝母组织培养物研究

王跃华，林抗雪，刘益丽，马良良，代 勇，徐世军，王晓蓉

(1.成都大学生物产业学院，四川成都 610106;2.成都恩威集团(投资)有限公司，四川成都 610041)

0 引言

1989年，Langis等首次报道了玻璃化法超低温保存的方法，其原理是将细胞或组织置于由一定比例的渗透性和非渗透性保护剂组成的玻璃化溶液中，在足够快的降温速度下，经高浓度玻璃化溶液作用后的组织细胞内外及其溶液因缺乏冰晶形成的条件而进入到无定型的玻璃化状态，并以这种玻璃化状态在低温下保存，此状态下由于没有冰晶对细胞的损伤，因而植物材料的存活率大大提高［1］.此方法免去了传统冷冻方法中复杂的程序性降温等步骤，具有设备简单、程序简化和冻存效果好等优点［2］.在利用玻璃化法保存植物材料的过程中，玻璃化溶液脱水处理时间的掌握以及对保存材料的选择是影响植物材料保存效果的关键因素.玻璃化脱水处理时间的长短将决定着保存材料是否充分脱水以及玻璃化溶液是否充满组织细胞间，进而影响材料的保存效果.由于植物的基因类型，抗冻性，以及器官、组织、细胞的生理状态等因素对超低温保存的效果有较大影响［3］.因此，在对植物进行超低温保存前，对保存材料的选择极其重要.本研究将玻璃化法首次应用于川贝母芽、愈伤组织和鳞茎的超低温保存中，以期找到最适宜于用玻璃化法保存的川贝母材料.

1 材料与方法

1.1 材料选择

实验材料来自成都大学生物产业学院组培室，分别选取继代培养15 d的优质川贝母芽、愈伤组织和鳞茎作为实验材料.

1.2 溶液配制

(1)100%玻璃化溶液II.分别量取238 mL甘油、134.5 mL乙二醇、136.5 mL DMSO，再称取171 g蔗糖，于1 000 mL烧杯中依次用蒸馏水溶解后定容.

(2)60%玻璃化溶液II.将100%玻璃化溶液II与MS液体培养基附加0.5 mol/L蔗糖的溶液以体积比为60∶40进行混合.

1.3 预培养

选取实验材料后将其接入MS+30 g/L蔗糖+ 5%二甲基亚砜的固体培养基中，于室温为20℃，光照强度1 200 lx，12 h/d的条件下预培养6 d.

1.4 玻璃化法保存

取预培养后的实验材料，将其切为3 mm×3 mm× 2 mm大小后装入10 mL冷冻管中，每管装入4块.在常温下加入60%玻璃化溶液II，装载25 min后，再于2℃下加入100%玻璃化溶液II，分别脱水处理30 min、45 min、60 min、75 min，然后直接投入液氮中保存.

1.5 冻后材料的解冻与洗涤

在液氮中保存5 d后将冷冻材料取出，立即放入40℃恒温水浴锅中进行快速解冻.完全解冻后用MS液体培养基附加1.0 mol/L蔗糖的溶液进行浸泡洗涤，每次10 min，重复处理3次后吸出洗涤液并用蒸馏水冲洗干净.

1.6 冻后材料TTC值测定

洗涤完毕后，将材料置于小烧杯中，加入已用磷酸缓冲溶液调节pH值为7的0.4%TTC(2，3，5-氯化三苯基四氮唑)溶液，常温黑暗条件下染色18 h.充分染色后吸去TTC溶液，用蒸馏水洗涤数次，滤纸吸水后加入10 mL 95%乙醇置于40℃恒温水浴锅中进行TTF的提取，直至材料无色，取上清液用UV-1100型紫外分光光度计在485 nm下测定其吸光值.上述每个处理重复测定3次，取其平均值，计算冻后材料细胞的相对存活率，

2 结果与讨论

2.1 不同脱水时间对川贝母芽保存效果影响

植物体的芽为植物中尚未充分发育和成长的枝条，是枝条的雏型.组织培养中的芽可通过进一步生长分化成为无根苗，诱导生根后即可成为完整的无菌苗.川贝母芽保存后的存活率如表1所示.

表1 川贝母芽保存后的存活率

表1数据显示，当川贝母芽的脱水时间在30～60 min之间时，随着脱水时间的逐渐增加，其保存后川贝母芽的存活率也逐渐增大，并在60 min时达到最大，存活率可达51.20%.其后，随着脱水时间的继续增加，保存材料的存活率呈现出明显下降的趋势，脱水时间增加到75 min时，其保存后材料的存活率仅为22.22%.

在实验中，采用玻璃化溶液对保存材料进行适当的脱水处理，从而使材料适度脱水，在此条件下快速冷冻材料组织，细胞内外将进入无定型的玻璃化状态，细胞内无冰晶的形成，材料相对存活率也将大大提高.进一步分析可看出，脱水时间为60 min保存后的川贝母芽的存活率达到最高，说明此时玻璃化溶液已充满其细胞内外，材料细胞处于最适度的生理脱水状态，此时材料最宜于保存.由于用玻璃化溶液脱水处理材料的过程中，高浓度的玻璃化溶液与细胞内液形成了较高渗透势，细胞内的水分将逐渐脱出，同时组成玻璃化溶液中一些渗透性的物质分子如二甲基亚砜、乙二醇、甘油能很快渗透到组织细胞内与水分子结合从而增大了溶液的粘性弱化水的结晶过程，而玻璃化溶液中一些非渗透性的物质如蔗糖进入组织细胞间隙的溶液中，也降低了溶液的冰点.

2.2 不同脱水时间对川贝母愈伤组织保存效果影响

愈伤组织是植物组织培养中最为常见的物质，具有生长速度快并可分化成为各种组织和器官的潜力，但愈伤组织在长时间的继代过程中细胞易发生染色体的畸变.川贝母愈伤组织保存后的存活率如表2所示.

表2 川贝母愈伤组织保存后的存活率

表2数据显示，采用不同脱水时间处理的玻璃化法保存川贝母愈伤组织，其存活率的变化规律与川贝母芽基本一致，其最佳脱水处理时间也为60 min，但在此条件下保存的愈伤组织其存活率为80.81%，明显高于芽.

进一步分析表明，由于愈伤组织材料较芽体而言，其细胞分化程度更低，细胞分裂活动更旺盛，因而愈伤组织处于有丝分裂前后的细胞也更多.通常，处于有丝分裂前后的细胞具有细胞质黏稠、细胞壁薄、液泡化程度低等适宜超低温保存的特点［4］，因而使得材料在冷冻保存过程中细胞内不易形成冰晶，大大地提高了冷冻保存材料的抗冻能力.

2.3 不同脱水时间对川贝母鳞茎保存效果影响

鳞茎是川贝母植物的药用部位，是著名的川产地道药材之一，具有止咳化痰、清热润肺等功效.同时，鳞茎也是川贝母植物无性繁殖的重点器官.川贝母鳞茎保存后的存活率如表3所示.

表3 川贝母鳞茎保存后的存活率

表3数据显示，在采用玻璃化法保存川贝母鳞茎的过程中，用玻璃化溶液进行不同脱水时间处理后，冷冻保存后的川贝鳞茎存活率存在较大差异.随着脱水时间的增加其存活率不断升高，60 min时达到最高为48.50%，但超过60 min后其存活率明显下降，75 min时仅为21.04%，为3种保存材料中最低的.

2.4 实验结果分析

从实验测得的3种未冻存材料的TTC平均值大小看，未冻存愈伤组织的TTC值最高为2.230，未冻存芽的TTC值2.156，未冻存鳞茎的TTC值最低为1.730.由于TTC值的大小可反应细胞内脱氢酶的活性，而脱氢酶的活性可表征组织细胞生命活动的旺盛程度，生命活动越旺盛，细胞的有丝分裂也相对越活跃，其处于有丝分裂前后的细胞也就越多，进而其组织细胞的抗冻能力越强.由于鳞茎的TTC值相对最低，因此其细胞抗冻能力也就相对最弱，冻存后材料的存活率也就相对最低.所以，在用玻璃化法保存植物材料时对保存材料的选择是影响材料保存效果最为关键的因素.

3 结语

在超低温保存植物种质材料的过程中，保存材料的选择极为关键.赵艳华等［5］在超低温保存苹果离体茎尖时发现，材料的生理状态对茎尖存活率的影响甚至比保存过程中处理因素的影响更大.本研究选取了继代15 d的优质川贝母芽、愈伤组织和鳞茎作为实验材料，实验得出3种保存材料的最佳脱水时间均为60 min时，并且此时愈伤组织的存活率为80.81%，明显高于芽的存活率51.20%和鳞茎的存活率48.50%.本研究也进一步证实了，分化程度越低的材料因其处于分裂期前后的细胞越多，抗冻能力也越强，保存后材料的存活率也越高的结论.

此外，玻璃化溶液脱水处理时间是保存种质资源的决定性因素.本研究对玻璃化法保存川贝母的芽、愈伤组织和鳞茎的脱水处理时间进行了筛选.实验结果表明，不同的脱水处理时间对冻存后材料的存活率有明显影响.

［1］梁宏，王起华.植物种质的玻璃化超低温保存［J］.细胞生物学杂志，2005，27(1):43－45.

［2］覃灵华，刘华英.玻璃化法超低温保存植物种质资源及其研究进展［J］.作物杂志，2008，24(3):20－23.

［3］刘云国，王晓云.果树种质源超低温保存研究进展［J］.生命科学研究，2001，5(3):227－232.

［4］王君晖，黄纯农.玻璃化法——园艺作物茎尖和分生组织超低温保存的新途径［J］.园艺学报，1994，21(3):277－287.

［5］赵艳华，吴永杰，陈霜莹.包埋干燥超低温保存苹果离体茎尖［J］.园艺学报，1988，15(1):93－95.