L－半胱氨酸缩邻香草醛Co（Ⅱ）配合物的合成、表征及与DNA的作用研究＊

董丽丽，范玉华，刘善斌，张 霞，毕彩丰

（中国海洋大学化学化工学院，海洋化学理论工程技术教育部重点实验室，山东青岛266100）

氨基酸类希夫碱是一类重要的生物配体，对该配合物的深入研究，有助于了解生物体中氨基酸与金属离子间的键合作用，有助于揭示金属离子在生物体内的生理生化功能、化学行为及作用机理，并对合理设计、目标合成和筛选高效、低毒、高选择性的抗菌、抗癌药物具有重要的理论价值。L－半胱氨酸是一种具有生理活性的α－氨基酸，在医药、食品及化妆品等生产中有着广泛的应用［1－2］。DNA是染色体的主要化学成分，遗传信息的载体，研究分子与DNA的作用，对于发现新的DNA靶点药物先导化合物具有重要意义。在金属配合物与DNA相互作用的研究领域，普遍认为金属配合物与DNA共有3种作用方式：静电作用、沟槽结合和插入结合［3－5］。本文首次以L－半胱氨酸和邻香草醛为原料，制备了L－半胱氨酸缩邻香草醛配体及其Co（Ⅱ）配合物。通过元素分析，核磁共振、红外光谱，紫外－可见光谱，摩尔电导分析及TG－DTG等方法对Co（Ⅱ）配合物的结构进行了表征，确定了该配合物的组成，推测了其可能的结构，并对Co（Ⅱ）配合物与DNA的作用方式进行了探讨。

1 实验材料仪器与方法

1.1 仪器与试剂

L－半胱氨酸（L－cys），（天津博迪化学试剂有限公司），邻香草醛（ovani），（百灵威），氯化钠，（天津市广成化学试剂有限公司），六氰合铁（Ⅱ）酸钾，（广东光华化学厂有限公司），Co（CH3COO）2·4H2O，（中国上海江浦化学制品厂），无水乙醇，（烟台三和化学试剂有限公司），无水甲醇，（烟台三和化学试剂有限公司），二甲基亚砜（DMSO），（天津市广成化学试剂有限公司）均为分析纯试剂，使用前未经过进一步纯化。三羟甲基氨基乙烷，（国药集团化学试剂有限公司），CT－DNA（日本TCI）均为生化试剂。Vario－EL－cube型元素分析仪（美国），AVANCEⅢ（600 MHz）核磁共振仪（日本电子株式会社），AVATAR 360 FT－IR型红外光谱仪（美国），UV－2550紫外－可见分光光度计（中国北京），DDS－312A型电导率仪（上海大中分析仪器厂），NETZSCH热重分析仪（德国），日立F－4600荧光光谱仪（中国北京）。

1.2 配体与配合物的合成

1.2.1 配体的合成 称取1.361 g（10 mmol）乙酸钠置于100 m L圆底烧瓶中，加入25 m L蒸馏水溶解。将1.212 g（10 mmol）L－半胱氨酸的乙醇溶液加入上述溶液中，搅拌至均匀。再将含有1.522 g（10 mmol）邻香草醛20 m L乙醇溶液逐滴加入到上述混合溶液中，室温下搅拌24 h，得白色沉淀，冰浴搅拌1 h，使产物充分沉淀，减压抽滤，用无水乙醇洗涤多次，得白色粉末，将产物真空干燥保存。分子式为：C11H13NO4S，相对分子质量为：255.3。Wcal／%：C 51.29，H 4.60，N 5.43，S 12.19；Wmea／%：C 51.70，H 5.09，N 5.48，S12.19。

1.2.2 配合物的合成 称取0.255 g（1.0 mmol）配体（L－cys－ovani）加入含少量DMSO的甲醇溶液，加热搅拌使其完全溶解，将含有1.0 mmol的Co（CH3COO）2·4 H2O的乙醇溶液逐滴加入到上述配体溶液中，50℃反应4 h，得褐色沉淀，过滤，用甲醇洗涤多次，干燥保存。Wcal／%：C 47.13，H 4.53，N 4.23，S 9.67；Wmea／%：C 47.52，H 4.38，N 4.38，S 9.87。1.3配合物与DNA作用机理研究所用的表征仪器和分析方法

1.3.1 溶液的配制：（1）缓冲溶液：用二次蒸馏水配制，含5.0×10－3mol·L－1的Tris，5.0×10－2mol·L－1的NaCl，盐酸调节酸度为p H＝7.2。

（2）CT－DNA溶液的配制：称取5.0×10－3g CT－DNA溶于50 m L p H＝7.2的Tris－HCl缓冲溶液中，使其形成均匀溶液。

（3）Co（Ⅱ）配合物溶液的配制：将Co（Ⅱ）配合物加入到p H＝7.2的Tris－HCl缓冲溶液中，配制浓度约1.0×10－5mol·L－1的溶液。

（4）实验试样系列：在10 m L容量瓶中加入一定量的Co（Ⅱ）配合物，再分别加入不同体积的DNA溶液，然后以p H＝7.2的Tris－HCl缓冲溶液定容，避光作用12 h以上。

1.3.2 紫外－可见光谱 向1 cm的比色皿中加入p H＝7.2的Tris－HCl缓冲溶液，用其调零并作为参比，在200～320 nm波长范围内对实验试样进行扫描。1.3.3荧光光谱 采用1 cm的比色皿，对试样进行3D扫描，确定配合物的最佳激发波长，在最佳激发波长下对试样系列测定荧光光谱。

1.3.4 离子强度的影响 在荧光光度计样品池中加入一定体积的Co（Ⅱ）配合物和DNA，用微量进样器依次往样品池中加入一定量的NaCl溶液，使NaCl溶液与Co（Ⅱ）配合物的浓度比值不断增加，在最佳激发波长下，测定荧光强度。

1.3.5 荧光猝灭 在荧光光度计样品池中加入一定体积的Co（Ⅱ）配合物和DNA，用微量进样器依次往样品池中加入一定量的K4［Fe（CN）6］溶液，使K4［Fe（CN）6］溶液与Co（Ⅱ）配合物的浓度比值不断增加，在最佳激发波长下，测定荧光强度。

1.3.6 黏度测定 在测定黏度时，温度恒定在（25±0.1）℃。测定液按固定DNA的浓度，逐渐增加Co（Ⅱ）配合物浓度配置，测定液的相对黏度按下式计算［3］：η＝（t－t0）／t0，式中t0表示缓冲溶液流经乌氏黏度计的时间，t为DNA溶液（含浓度不等的Co（Ⅱ）配合物）流经乌氏黏度计的时间。以（η／η0）1／3对r（r＝［Co］／［DNA］）作图，η0为未加Co（Ⅱ）配合物时DNA溶液的相对黏度。

2 结果与讨论

2.1 结构表征

2.1.11H NMR谱分析 配体和配合物的1H NMR谱图如下所示。

图1中，1H NMR（600 MHz CD3SO）：δ10.25（s，1H），归属为COOH上的H；δ6.89（m，3H）归属为苯环的H；δ5.84（s，1H）为OH上的H；δ5.64（s，1H）与苯环相连的次甲基H；δ4.19（t，1H）与羧基相连的次甲基H；δ3.76（d，3 H）甲氧基上的H；δ3.18（m，2H）亚甲基H；δ2.94（s，1H）氨基上的H。通过上述分析，配体在8.6附近没有化学位移，说明没有希夫碱的生成，而是氨基、巯基与醛基发生了闭环反应，生成了噻唑酸。其结构式如下：

图2中，与配体相比，Co（Ⅱ）配合物在9.77 ppm处羧基H的化学位移依然存在，说明羧基并没有以羧酸根的形式参与配位，配合物在5.50 ppm附近没有出现化学位移，说明OH的H已经失去，羟基以脱去H原子的方式参与了配位。3.84 ppm处的化学位移说明甲氧基的氧没有参与配位，1.21 ppm处出现了新的化学位移，为醋酸根中甲基上H的化学位移，说明亚仲配合物中存在醋酸根，2.97 ppm处为仲氨基的H的化学位移，与配体3.04 ppm相比，发生偏移，说明仲氨基参与了配位。

2.1.2 红外光谱 采用KBr压片法，波长扫描范围为4 000～400 cm－1。

（1）配体在3 419 cm－1处的吸收峰归属为酚羟基的OH伸缩振动，3 089 cm－1处的吸收峰为仲氨基的N－H伸缩振动峰，也进一步说明没有生成希夫碱。2 900及2 800 cm－1左右的峰归属为饱和C－H的伸缩振动，2 600及2 400 cm－1处的宽峰说明羧基是以分子间缔合的方式存在。1 624 cm－1处的吸收峰为羧酸中羰基的振动峰，由于形成了分子间缔合，所以使得峰值向低波数移动，1 482 cm－1处的吸收峰可认为是C－C单键的伸缩振动峰，1 357 cm－1为C－N的伸缩振动峰，1 268 cm－1处归属为甲氧基的C－O伸缩振动峰，而1 065 cm－1可认为是酚羟基的C－O振动峰。

（2）游离醋酸根离子的υas（coo－）与υs（coo－）大约分别在1 560和1 416 cm－1处［6］，在与过渡金属离子Co（Ⅱ）形成配合物后，υas（coo－）与υs（coo－）均发生了变化，υas（coo－）在1 584cm－1处，υs（coo－）出现在1 444 cm－1处，且Co（Ⅱ）配合物中相对应的υas（coo－）与υs（coo－）差值均小于200 cm－1，接近双齿配位范围，说明醋酸根的氧原子以双齿形式参与了配位。Co（Ⅱ）配合物中酚羟基的C－O振动峰大约在1 210 cm－1处，与配体相比发生了明显的偏移，说明酚羟基参与了配位。Co（Ⅱ）配合物中在3 089 cm－1处附近没有出现尖峰，说明N参与了配位。而甲氧基的吸收峰没有明显偏移，说明甲氧基的O原子没有参与配位。

2.1.3 紫外－可见光谱 在DMSO溶液中测定配体与Co（Ⅱ）配合物的紫外光谱，Co（Ⅱ）配合物在200～320 nm范围内有2处吸收峰。208 nm处的吸收峰归属为苯环的π–π＊电子跃迁。256 nm处的吸收峰归属为配体与金属离子发生的LMCT（ligand to metal charge transfer）跃迁，表明金属离子与配体发生了反应，生成了配合物。

2.1.4 配合物的电导率及摩尔电导率 以DMSO为溶剂，在浓度为0.97×10－3mol·L－1时，测得Co（Ⅱ）配合物的摩尔电导率为23.12S·cm2·mol－1，其数值小于35S·cm2·mol－1，可以认为该配合物为非电解质［7］，即COO－参与了配位。

2.1.5 配合物的热分解动力学研究 在升温速率10℃·min－1和N2氛围条件下，测定了Co（Ⅱ）配合物的热分析（TG－DTG）曲线，如图3所示。

图3 配合物［Co2（C11 H 12 NO4 S）2（CH 3 COO）2］的TG－DTG曲线Fig.3 TG－DTG curves of the［Co2（C11 H 12 NO4 S）2（CH 3 COO）2］

Co（Ⅱ）配合物的热分解是在室温至800℃温度区间内测定的。第一步热分解的温度区间为25～150℃，失重率为13.87%，与失去两分子醋酸根的计算值（13.11%）基本相符。150～800℃为配合物的逐步分解过程，温度至800℃时，残重率为19.92%，与理论残重计算值19.87%相符，热分解残余物为CoO。

2.1.6 配合物可能的结构 由上述表征方法推出Co（Ⅱ）配合物的结构可能如下：

图4 Co（Ⅱ）配合物可能的结构图Fig.4 The suggested structure of the Co（Ⅱ）complex

2.2 Co（Ⅱ）配合物与DNA相互作用

2.2.1 Co（Ⅱ）配合物与DNA作用的紫外吸收光谱

紫外可见光谱是研究DNA与金属配合物结合方式的有效方法之一。固定配合物的浓度，逐渐加大DNA的浓度，避光静置12 h后测定其吸光度。从图5曲线的变化可知，随着DNA浓度的增加，紫外可见光谱发生了减色效应和微小红移，这是因为配合物的Co（Ⅱ）离子与DNA的碱基对发生了强烈的堆积作用所致。这表明Co（Ⅱ）配合物与DNA的作用方式很可能是插入作用［8］。

图5 不同浓度DNA与Co（Ⅱ）配合物相互作用的紫外吸收光谱图Fig.5 Electronic absorption spectra of the Co（Ⅱ）complex with increasing amounts of DNA

2.2.2 Co（Ⅱ）配合物与DNA作用的荧光光谱 Co（Ⅱ）配合物与DNA作用荧光光谱图如图6。

图6 不同浓度DNA与Co（Ⅱ）配合物相互作用荧光光谱图Fig.6 Emission spectra of Co（Ⅱ）complex with increasing amounts of concentrations of DNA

从荧光光谱图的变化可知，配合物的荧光强度随着DNA浓度的增加而增大，这是由于配合物插入到DNA的碱基对中，使配合物的发光基团进入疏水环境，避免了水分子的猝灭作用，从而使配合物的荧光强度增强［9］。这进一步表示Co（Ⅱ）配合物与DNA的相互作用方式可能为经典插入作用。

2.2.3 离子强度对Co（Ⅱ）配合物与DNA作用的影响

通过加入NaCl来改变试样所处的离子强度环境，也是表征配合物与DNA作用的一种有效的方法。盐的阳离子可以中和DNA碱基对上磷酸根所带的负电荷，如果配合物通过静电作用与DNA结合，那么随着盐离子强度的增加，DNA表面会被Na＋阳离子包围，从而使配合物难以接近DNA，而使得配合物与DNA的作用减弱，进而使荧光强度减弱［10］。当配合物与DNA以沟面结合时，随着离子强度的增加，配合物与DNA的结合减弱导致配合物与DNA分开，荧光强度减弱。而当配合物与DNA以插入的方式结合时，离子强度则不会对配合物与DNA的作用产生明显的影响。固定DNA及Co（Ⅱ）配合物的浓度，逐渐增加NaCl的浓度，使Na＋的离子强度不断增加，如图7所示，随着离子浓度的增加，荧光强度并没有发生明显的变化，说明Co（Ⅱ）配合物与DNA的作用方式不是静电作用或沟面结合，应该是以插入方式结合的。

图7 NaCl对Co（Ⅱ）－DNA体系荧光强度的影响Fig.7 Effect of fluorescence spectra of Co（Ⅱ）－DNA with increasing amounts of NaCl

2.2.4 ［Fe（CN）6］4－对Co（Ⅱ）配合物与DNA作用的荧光猝灭作用 以［Fe（CN）6］4－作为猝灭剂，比较荧光猝灭剂对发光物质在结合DNA作用前后发光猝灭的差异，是研究配合物与DNA相互作用的另一种简便而有效的方法［10］。在缓冲溶液中配合物以阳离子的状态存在，其荧光被高负电荷的［Fe（CN）6］4－所猝灭［11］。配合物与DNA发生插入结合后，配合物就会受到DNA的保护，由于DNA螺旋表面的磷酸根负电荷的排斥，使猝灭剂很难接近配合物阳离子，则［Fe（CN）6］4－对配合物的荧光猝灭程度将降低。图8给出了［Fe（CN）6］4－对配合物与DNA作用的荧光猝灭曲线。从图中可见，在无DNA存在时，Co（Ⅱ）配合物的荧光能被［Fe（CN）6］4－迅速的猝灭，但是当Co（Ⅱ）配合物与DNA相互作用后，因受到DNA的保护，降低了［Fe（CN）6］4－对Co（Ⅱ）配合物荧光的猝灭效率，同时由于Co（Ⅱ）配合物与DNA作用以后的猝灭曲线近似于1条斜率为零的直线，进一步表明Co（Ⅱ）配合物与DNA是以插入模式作用的。

图8 ［Fe（CN）6］4－对Co（Ⅱ）－DNA体系的荧光猝灭曲线Fig.8 Emission quenching curves of the Co（Ⅱ）－DNA by quencher［Fe（CN）6］4－

2.2.5 黏度的测定 光谱学性质的研究虽然得到了一致的结果，但是仍不足以证明配合物与DNA的结合方式。为进一步明确配合物与DNA的作用方式，本文对Co（Ⅱ）－DNA体系的黏度进行了测定。液体的流动性对体系内分子长度的变化非常敏感，因此在缺乏晶体学数据的情况下，黏度法对配合物与DNA结合方式进行测定是比较可靠的方法。

图9 Co（Ⅱ）配合物浓度对DNA黏度的影响［Co］／［DNA］＝0，0.2，0.4，0.6，0.8，1.0）Fig.9 Effects of increasing amounts of the Co（Ⅱ）complex on the relative viscosity of DNA［Co］／［DNA］＝0，0.2，0.4，0.6，0.8，1.0

在经典的插入作用模式中，DNA的双螺旋变长，从而使碱基对分开，以便有足够的空间来结合配合物，这使得DNA溶液的黏度增加。与此相反，部分插入或者非经典插入中，配合物可以使DNA螺旋弯曲或者扭曲，从而降低了DNA的黏度。还有一些配合物是通过静电方式与DNA结合的，对DNA的黏度没有影响［12］。如图9所示，黏度测试的结果清楚的表明，Co（Ⅱ）配合物可以插入DNA邻近的碱基对中，导致DNA螺旋结果的伸长，从而使DNA的黏度增加。

3 结语

本文合成了1种新的Co（Ⅱ）配合物，通过元素分析、核磁共振、红外光谱、紫外－可见光谱、摩尔电导率分析及TG－DTG等手段对合成的Co（Ⅱ）配合物进行了表征，推测双核配合物的组成为［Co2（C11H12NO4S）－2（CH3COO）2］。进一步通过紫外－可见光谱，荧光发射光谱，离子强度改变，［Fe（CN）6］4－荧光猝灭及黏度测定等方法对Co（Ⅱ）配合物与CT－DNA结合方式进行了研究，证明Co（Ⅱ）配合物与CT－DNA结合方式为插入结合。

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