栉孔扇贝（Chlamys farreri）壳顶幼虫血细胞分布的免疫学观察＊

倪永庆，邢 婧，林听听，战文斌

（中国海洋大学海水养殖教育部重点实验室，山东青岛266003）

血细胞是贝类免疫防御系统重要的组成部分，可参与炎症、伤口修复、呼吸爆发、吞噬和包囊等作用［1］。1960－1970年代，研究者们主要对贝类血细胞分类和结构进行研究；1980年代以后，贝类血细胞的免疫防御功能备受关注［2－4］。近年来，贝类血细胞的发生和分化开始成为研究热点，研究者们多采用单克隆抗体对贝类血细胞进行组织定位，在应用抗血细胞单克隆抗体对紫贻贝（Mytilus edulis）各期胚胎幼虫研究中发现在第1～4天的幼虫出现了血细胞［5］；在牡蛎（Ostrea edulis）中应用抗颗粒细胞单克隆抗体发现了其颗粒细胞出现在第30～32天牡蛎幼虫鳃的结缔组织和上皮细胞之间［6］。研究组在制备出抗栉孔扇贝（Chlamys farreri）血细胞的单克隆抗体的基础上，应用单克隆抗体定位了栉孔扇贝稚贝的造血组织［7］；并发现血细胞出现在D形幼虫期，数量较少，分布仅局限于消化器官周围［8］。相比于D形幼虫，壳顶幼虫的细胞与组织分化快，消化器官、循环系统等发育更加完善，功能增强。本文采用半薄切片的组织化学染色法和单克隆抗体的免疫组化方法、免疫电镜方法，研究栉孔扇贝D形幼虫期后的壳顶幼虫血细胞的形态特征与分布特点，以期为研究和阐明扇贝各发育阶段血细胞的发生与分化积累资料。

1 材料和方法

1.1 材料及试剂

栉孔扇贝壳顶幼虫采集于山东寻山水产集团海珍品综合养殖场，经显微镜测量其壳长×壳高为（125～156）μm×（105～138）μm［9］。采集的壳顶幼虫样品经2.5%戊二醛前固定，1%锇酸后固定，经梯度丙酮脱水，环氧树脂包埋，聚合，超薄切片机连续切片。半薄切片厚度为2μm，脱去树脂［10］，用于爱氏苏木精与曙红染色（H＆E染色）与免疫组化；超薄切片厚度为70 nm，用于免疫电镜。

免疫组化所用的第一抗体为四株抗栉孔扇贝血细胞单克隆抗体（1E7，1F12，2C6，2 H5）的混合抗体，由本实验室研制［11］。生物素化马抗小鼠IgG（H＋L）、碱性磷酸酶标记链亲和素、碱性磷酸酶底物AP－Red试剂盒购自北京中杉金桥生物公司，胶体金（SPA）标记羊抗小鼠IgG购自SIGMA公司，金颗粒直径为10 nm。牛血清蛋白（BSA）购自AMRESCO公司。锇酸及环氧树脂（Epon－812）购自SERVA公司。

1.2 方法

1.2.1 H＆E染色与免疫组化 将半薄切片置于爱氏苏木精染液内，60℃染色1 h，蒸馏水冲洗1 min，1%曙红染10 min，蒸馏水冲洗，50%缓冲甘油封片，显微镜（OLYMPUS BX－51）观察，拍照。用于免疫组化的半薄切片，首先加0.3%乙酸室温孵育10 min，以抑制内源酶活性，然后用含0.1%Tween－20的0.01 mol·L－1磷酸盐缓冲液（PBST，p H＝7.4）浸洗5 min；加5%牛血清白蛋白孵育室温封闭30 min；加抗栉孔扇贝血细胞混合单克隆抗体为第一抗体，37℃孵育1 h，PBST浸洗3次，每次5 min；然后加生物素化马抗小鼠IgG（稀释比例1∶600），37℃孵育45 min，PBST浸洗3次，每次5 min；再加碱性磷酸酶标记链亲和素（稀释比例1∶500），37℃孵育45 min，PBST浸洗3次，每次5 min。最后，以碱性磷酸酶底物AP－Red试剂盒底物发色5 min，蒸馏水冲洗，苏木精衬染3 min，0.1%HCl酒精分色，蒸馏水冲洗，蓝化，伊文思蓝再次衬染2 min，蒸馏水冲洗，50%缓冲甘油封片，显微镜观察，拍照。阴性对照以骨髓瘤细胞（P3U1）培养液上清液代替混合抗体作为第一抗体。

1.2.2 免疫电镜 超薄切片经1%H2O2处理30 min以暴露抗原，之后以超纯水清洗；5%BSA封闭30 min，加入混合抗体为第一抗体，37℃孵育1 h，PBST浸洗3次，每次5 min；加入胶体金标记羊抗小鼠IgG（稀释比例1∶100）为第二抗体，37℃孵育1 h，PBST浸洗3次，每次5 min，再以超纯水浸洗3次，每次3 min，自然晾干；经5%醋酸铀染20 min，超纯水洗3次，每次3 min；枸橼酸铅染色15 min，超纯水充分洗净；干燥后在JEM－1200EX型透射电子显微镜下观察，拍照。阴性对照以P3U1代替混合单抗作为一抗。

2 结果

2.1 H＆E染色观察

半薄切片H＆E染色观察发现，栉孔扇贝壳顶幼虫组织器官分化清晰，界限明显。外缘为外套膜，内脏团包括面盘、口、消化道、胃、消化腺、足等（见图1A）。面盘收缩于外套膜内，表面具有密集的纤毛。口位于面盘一侧，连接着狭隘而短的食道。胃与食道相连，为膨大的囊状，约占幼虫体积的1／3，可见胃腔内食物。消化腺围绕在胃和消化道附近。足位于内脏团的一侧，呈椭圆形。幼虫体内细胞以成簇或游离状分布，呈圆形或椭圆形，直径为3～5μm，H＆E染色细胞核呈蓝紫色，细胞质呈暗红色（见图1B）。游离的细胞数目少，成簇分布的细胞数量多，大小不一，聚集分布于外套膜、面盘、食道、消化腺、胃等处。

图1 栉孔扇贝（Chlamys farreri）壳顶幼虫的H＆E染色结果Fig.1 H＆E staining observation of umbolarvae in Chlamys farreri

2.2 免疫组化观察

半薄切片免疫组化结果发现，阳性信号（红色沉淀）出现在壳顶幼虫的外套膜、面盘、食道、消化腺、胃等组织器官内的细胞中，阳性细胞清晰可辨，直径为3～5μm，细胞质呈红色，细胞核呈蓝色，说明该时期幼虫体内血细胞分布广泛（见图2A）。根据阳性细胞的分布可见，外套膜组织内的血细胞散在分布，呈梭形或椭圆形；在面盘顶部与食道附近有少量游离血细胞的存在；在面盘基部、消化腺和胃的周围血细胞数量多，大小不一，形态多样，并且相互聚集成簇。阴性对照无阳性信号出现（见图2B）。本结果与H＆E染色观察的细胞分布特点相似，证实所观察的细胞主要为血细胞。

2.3 免疫电镜观察

免疫电镜结果发现，胶体金颗粒结合的血细胞分布在壳顶幼虫的外套膜、面盘、食道、消化腺、胃等组织器官内。血细胞直径3～5μm，呈不规则状。细胞核多位于细胞一侧，常染色质电子密度低，异染色质电子密度高，分布于核周缘和常染色质之间。细胞质电子密度相对低，可见线粒体、粗面内质网等细胞器以及空泡。不同组织中，血细胞形态结构略有差异：消化腺组织内的血细胞，密集而挤压，细胞边缘不规则，细胞核呈肾形或不规则状，胞质内有多个线粒体和粗面内质网，核质比高（见图3A）。面盘组织内的血细胞，呈多边形，细胞核椭圆形，胞质内细胞器较少，仅有少量线粒体，核质比低（见图3B）；在血细胞内均可见大小一致、电子密度高而清晰的圆形胶体金颗粒，胶体金颗粒多呈点状分布在血细胞的细胞质以及核质交界区域，在细胞核与细胞膜也有少量胶体金颗粒的分布。

3 讨论

本文通过半薄切片H＆E染色法和单克隆抗体的免疫组化、免疫电镜法定位栉孔扇贝壳顶幼虫的血细胞，观察血细胞的分布特点。结果表明，栉孔扇贝壳顶幼虫外套膜、面盘、口、食道、消化腺、胃、足等组织器官分化清晰；壳顶幼虫的外套膜、面盘、食道、消化腺、胃等组织器官内及周围广泛分布着血细胞，其中面盘、消化腺、胃等处有大量血细胞聚集成簇。

研究组前期应用单克隆抗体的免疫组化方法研究栉孔扇贝血细胞的胚胎发生时相，在囊胚期、原肠胚期、担轮幼虫期均未出现阳性信号，阳性信号出现于D形幼虫期，但该时期血细胞数量较少，分布也比较局限，仅分布于幼虫消化组织器官周围，血细胞内部形态不易分辨［8］。与D形幼虫相比，壳顶幼虫的阳性信号明显增强，分布位点也明显增多，说明大量血细胞已经出现在壳顶幼虫体内，并且广泛分布于外套膜、面盘、食道、消化腺、胃等器官，其形态结构清晰可辨，胞质内含有多个线粒体。血细胞在消化食物、吞噬异物和降解废物过程中需要大量能量，可推测血细胞参与幼虫营养物质的吸收、消化和运输等功能。

在组织形态学研究方面，多采用石蜡切片，但由于本实验中栉孔扇贝（壳顶幼虫）个体较小，壳长仅为125～156μm，前期工作用石蜡包埋切片厚度在5～7μm之间，染色后观察发现细胞重叠多，无法清晰地观察到壳顶幼虫的组织结构和血细胞的内部形态。半薄切片是经环氧树脂包埋，厚度在1～2μm的薄片，在高倍镜下视野清楚，细胞重叠少，结构清晰度高，细胞界限分明，而且半薄切片是电镜超薄切片技术中一种有效的定位方法。但该方法不能定性地研究血细胞除分布以外的其它特点，而且仅仅用H＆E染色观察不足以证明所观察到的细胞为血细胞，这需要借助抗栉孔扇贝血细胞的单克隆抗体，在幼虫中原位定位血细胞，以获得充足的证据。因此，本研究采用半薄切片H＆E染色法和免疫组化方法观察壳顶幼虫的组织结构，并原位定位血细胞的分布，结果发现壳顶幼虫已经分化出界限清晰的组织器官，并且发现与消化功能相关的组织器官内及周围广泛分布着血细胞。同时，本研究采用免疫电镜方法进一步定位观察幼虫体内各组织中血细胞的内部结构，结果发现组织内血细胞形状不规则，直径为3～5μm，细胞核多位于细胞的一侧，多为圆形或椭圆形，常染色质电子密度低，异染色质电子密度高，分布于核周缘和常染色质之间，细胞质内含有线粒体、内质网等细胞器和空泡。本研究采用半薄切片H＆E染色、免疫组化和超薄切片免疫电镜方法互相对照，更加详尽地解析壳顶幼虫组织结构与血细胞分布的特点。

免疫组化结果基本印证了半薄切片H＆E染色结果中血细胞的分布特点，但略有不同，免疫组化结果并非所有的血细胞都显示为阳性。究其原因，第一种可能是因为经环氧树脂包埋，高温聚合、脱树脂等处理，虽然保证了样品的形态结构，但高温聚合对细胞的影响较大，容易出现细胞浆破坏、核破裂等现象，不可避免使样品抗原决定簇受到破坏；第二种可能是因为栉孔扇贝血细胞的单克隆抗体是抗成熟血细胞某一特定抗原决定簇，而壳顶幼虫组织中血细胞处于发生、分化和未成熟阶段，其抗原决定簇的类型和数量与成熟血细胞稍有差异；第三种可能是因为切片的角度或厚度并未暴露其相应的抗原决定簇所致。

有关栉孔扇贝血细胞的研究报道都集中于成体，但关于幼虫的研究较少。研究组前期对栉孔扇贝的成贝血细胞形态及其分类作了初步研究，并且初步定位了栉孔扇贝稚贝的造血组织［12，7］。本研究未发现到栉孔扇贝壳顶幼虫中颗粒血细胞和透明血细胞的类型分化，以及类似稚贝造血组织的结构。今后可进一步通过不同类型血细胞的单克隆抗体对不同时期幼虫血细胞的发生、分化和成熟过程进行深入地研究。

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