光激化学发光免疫分析法测定低浓度HBsAg效果评价

陈桂兰，陆 燕

(广西壮族自治区来宾市人民医院检验科 546100)

HBsAg为HBV感染的最主要病原标志和直接证据之一,目前中国大多数实验室采用酶联免疫吸附试验(ELISA)及胶体金法进行检测，对于HBsAg低浓度的标本，检测时常因方法学的原因造成灵敏度较低,导致临床出现漏检等问题。光激化学发光免疫分析法(light initiated chemiluminescence assay,LICA)始于20世纪90年代问世的单线态氧分子能量传递发光免疫分析技术(luminescent oxygen channeling immunoassay，LOCI)，经过长时间的发展，国内已成功研制了基于LOCI检测原理的LICA及检测设备和相关试剂。本文使用LICA、ELISA及胶体金法同时测定经电化学发光免疫分析法(ECLIA)筛选的HBV定量检测阳性胶体金法标本吸光度与仪器所给临界值(Cut-off)的比值(COI)为1～50的临床标本80例,HBsAg COI<1的临床标本30例作为阴性对照，以广西壮族自治区临检中心提供的临界值控制品作为质控，现将评价效果报道如下。

1 资料与方法

1.1一般资料 80份经罗氏ECLIA筛选HBsAg COI 为1～50的低浓度临床标本来自本院门诊及住院患者(观察组)，乙型肝炎(简称乙肝)患者诊断符合国家标准。30份正常人血清来自本院健康体检者(对照组)。

1.2方法

1.2.1仪器及试剂 LICA HT 高通量免疫分析仪、LICA SP 全自动移液器以及试剂盒由上海博阳生物科技(上海)有限公司提供；罗氏COBAS e601电化学发光分析仪及配套试剂由瑞士罗氏公司提供；ELISA HBsAg试剂盒由英科新创(厦门)公司提供,Biocell- 2010酶标仪由博赛公司提供、BIO-RAD 1575洗板机由伯乐公司提供；胶体金法试剂由杭州艾康公司提供。广西壮族自治区临检中心提供的临界值控制品浓度为1 ng/mL。标准品为美国Abbott公司提供，血清定值为HBsAg 1 ng/mL。

1.2.2测定方法 (1) LICA测定HBsAg的含量采用双抗体夹心法，基础原理是一种均相免疫反应：均相条件下，将试剂1(R1，内部带有染料的纳米感光微粒)、试剂2(R2，内部带有发光化合物、包被有活性分子的纳米发光微粒)与待测样本进行混合。此时R1中的感光微粒和R2中的发光微粒可快速有效地捕捉待测物质，形成免疫复合物。复合物经过680 nm激发光照射后，感光微粒中的染料被诱导激活，并释放出高能态的单线态氧，而单线态氧能被近距离(200 nm)的发光微粒所俘获，发光微粒进而释放出高能级的红光(610 nm)，通过单光子计数器和数学拟合将光子数换算为靶分子浓度。当样本不含待测物质时，两种微粒间则无法形成免疫复合物，单线态氧在液相中迅速衰减，无法传递至发光微粒表面，检测时则无光子产生。(2) 罗氏ECLIA全自动仪器操作按照厂家说明书及科室的仪器标准操作程序(SOP)文件规定进行。(3) ELISA法严格按照厦门英科新创公司提供的说明书进行。(4) 胶体金法严格按艾康公司提供的说明书进行。

1.2.3结果判断标准 按照试剂盒说明，LICA>0.2 ng/mL可判断为阳性，ECLIA COI>1可判断为阳性，ELISA当OD/CO>1可判断为阳性，胶体金法出现2条带时可判断为阳性。

1.2.4评价方法 (1)灵敏度比较：标准品(HBsAg浓度1 ng/mL)用PBS-BSA液倍比稀释至0.5、0.25、0.12、0.06、0.03 ng/mL等已知浓度系列样品，分别使用LICA、ECLIA、 ELISA及胶体金法重复测定2次，比较各方法间的灵敏度。(2)精密度比较：对处于临界值的质控品连续检测5 d。每天2批，每批各重复5次，计算平均批内变异系数(CV)。由于胶体金法仅判断为阳性、弱阳性和阴性，本文对胶体金法的精密度不进行讨论。(3)4种方法检测HBsAg的比较：以ECLIA为比较对象，分析LICA、ELISA和胶体金法检测两组的样本，比较检出率和符合率。

1.3统计学处理 采用SPSS15.0统计软件进行分析，对ECLIA、LICA和ELISA 3种方法检测HBsAg的结果采用配对χ2检验，以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.14种检测方法测定HBsAg的灵敏度比较 HBsAg浓度为0.12 ng/mL 时ECLIA为阳性(COI>1)；HBsAg浓度为0.25 ng/mL时LICA为阳性；HBsAg浓度为0.50 ng/mL时ELISA为阳性(OD/CO>1)；HBsAg 浓度为1.00 ng/mL 胶体金法为阳性(试纸条出现2条红色带时)。见表1。

表1 4种方法测定HBsAg的灵敏度比较(ng/mL)

2.2ECLIA、LICA和ELISA 3种方法的CV比较 ECLIA、LICA和ELISA平均浓度分别为7.11±3.69(COI)、(1.08±0.57 )ng/mL和4.56±2.24(OD/CO)，CV分别为7.8%、8.6%和11.9%。

2.34种方法测定HBsAg结果比较 4种方法检测两组样本，以ECLIA法作比较，其中LICA检出率为98.7%，ELISA 法检出率为93.7%，胶体金法检出率仅为25.0%，见表2。

表2 4种方法HBsAg测定结果比较

3 讨 论

HBsAg是检测HBV首选的免疫学标志物，胶体金法和ELISA两步法检测HBsAg，在国内已被广泛采用，ELISA两步法虽在一定程度上能杜绝钩状效应(Hook效应)，但同时也可因灵敏度较低(<0.5 ng/mL)而出现漏检，而且ELISA方法由于要分离结合态的抗原(或抗体)与游离态的抗原(或抗体)，因此需要反复加样和洗板，引入的误差加大，加上酶标板的孔间存在差异等问题一直导致该法精密度较差。本次结果中，ELISA法的CV是11.9%，分析原因可能是由于选用了较低值的质控品(1 ng/mL)进行评价；对于低浓度的HBsAg标本(COI 1～50)，也因为方法灵敏度较低而出现假阴性[1]，本实验中出现5例假阴性；胶体金法虽然操作简单、方便，但由于其方法学的原因灵敏度更低，同样对低浓度HBsAg检测会产生假阴性结果[2]。

而ECLIA是近年来继荧光免疫法(FIA)、放射免疫法(RIA)和酶联免疫法(EIA)之后发展起来的新兴免疫标记技术，该技术使用的标记物稳定，无放射性污染，已发展成为国外检测病毒性肝炎血清学指标的重要方法[3]。与ELISA和胶体金法比较，ECLIA试剂的优势在于其不仅具有较高的灵敏度，而且还具有更宽的线性范围[4-5]。但是该方法所需仪器和试剂成本较高,不适宜在基层地方推广。

LICA技术使用了纳米级颗粒，增加了生物分子的包被面积，同时借助链霉亲和素-生物素放大系统，极大地提高了检测灵敏度，减少样本和试剂的用量，它避免了传统检测方法中繁琐的分离和洗涤步骤，有效降低了检测背景值，减少了反应时间，并可实现自动化操作[1,6-7]。目前还没有应用该原理的进口试剂，而国内已经研制了与该方法配套的检测病毒性肝炎标志物和相关肿瘤标志物的全自动检测系统。本文使用LICA对HBsAg的检测结果显示，LICA对HBsAg的分析灵敏度可达到0.25 ng/mL，80例阳性样本中仅1例未检出，与ECLIA测定结果最为相近。

本文对80例HBsAg低浓度标本检测结果显示，ELISA与胶体金法的漏检率为6.3%和75.0%，对低浓度样品易漏检，且无法得知被测物真正的浓度，给临床诊断和治疗带来许多不便。HBV血清标志物定量检测能较为准确地反映其血清中的含量，对临床药物疗效评价具有重要意义[8]。而LICA和ECLIA均可对HBsAg进行定量。本实验中LICA和ECLIA检出相符性很高，两种方法检测结果的符合率高达99.09%，对HBsAg的阳性率差异无统计学意义(P>0.05)，表明使用LICA可以在常规临床检测中替代ECLIA用于HBsAg定量检测。虽然对普通人群进行初筛时，检测方法使用高灵敏度方法进行检测是否存在医疗过度的问题尚存在争议，但由于LICA已经实现了仪器和试剂的国产化，成本较低，可以有效降低医疗费用。与ECLIA相比，LICA具备相近的检测性能，但可控制成本；与ELISA及胶体金法比较，LICA具有更高的敏感度并可简化操作步骤，使实验更快捷，且该法可进行自动化定量检测，可动态观察疗效和监测病情，适于临床使用。

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