远隔缺血后处理对兔心肌缺血/再灌注损伤保护作用的时效关系

魏江涛，陈 聪，方正旭，李 进，官 亮，刘海江

(南昌大学第四附属医院干部病区 330003)

心肌梗死对人类健康危害即可产生于缺血过程，也可出现于再灌注过程。近年来，有研究证实，心肌缺血期进行短暂肢体缺血/再灌注处理同样可以达到保护心肌的目的[1-2]。由于缺血/再灌注方案不同，其结果也大不相同。本文旨在研究远隔(下肢)缺血后处理时间长短对兔心肌缺血/再灌注损伤保护作用的影响，并探讨其相关性，为临床心肌缺血事件发生后心肌保护提供资料。

1 材料与方法

1.1材料 (1)实验动物：健康的新西兰兔54只，体质量3.0～3.5 kg，由江西中医学院动物实验中心提供。(2)主要实验仪器、试剂盒：LANDMARK AG-Ⅱ全自动生化分析仪，心电监测仪购自华南医电公司；离心机(TGL-168)购自上海安亭科学仪器厂,生化检测试剂盒购自美国R&D公司。麻醉用相关药品为氯胺酮、甲苯塞嗪、硫喷妥钠、阿托品。

1.2方法

1.2.1模型建立 采用Selye法结扎兔心脏冠状动脉左前降支(LAD)，制作急性心肌梗死(AMI)模型。以结扎冠状动脉远端心肌心电图在30 min内ST段、T段进行性抬高，结扎以下的心肌颜色变暗、心肌运动减弱为LAD成功结扎标志。

1.2.2动物分组及处理 实验动物分6组：假手术组(n=4)和A组、2次缺血5 min/灌注5 min组(B组)、3次缺血10 min/灌注5 min组(C组)、4次缺血5 min/灌注5 min组(D组)、4次缺血10 min/灌注5 min组(E组)5组各10只。处理措施如下：假手术组只穿线，不夹闭LAD；A组在夹闭LAD 30 min后，开放LAD实施再灌注6 h；B组在夹闭LAD 30 min后，开放LAD同时夹闭双下肢动脉5 min，然后开放5 min，重复缺血/再灌注，共2个循环，实施再灌注6 h；C夹闭双下肢动脉时间为10 min，3个循环缺血/再灌注；D组夹闭双下肢动脉时间分别为5 min、4个循环缺血/再灌注；E组夹闭双下肢动脉时间分别为10 min、4个循环缺血/再灌注。

1.2.3检测指标 (1)室性心律失常：记录缺血期及再灌注期室性心律失常发生类型，并对其评分[3]。0分，无心律失常；1分，偶发室性早搏(1 min<3次)；2分，频发室性早搏(1 min≥3次)；3分，偶发室性心动过速(1 min<3次)；4分，频发室性心动过速(1 min≥3次)；5分，频发室性颤动(1 min≥3次)或死亡。(2)生化指标：分别于缺血期及再灌注后3、6 h抽取动脉血5 mL，4 ℃下4 000 r/min离心10 min，取上清液，-80 ℃保存，采用全自动生化分析仪测定血浆肌钙蛋白(cTnT)的水平。(3)心肌梗死面积：以cTnT总释放量曲线下面积作为心肌梗死面积的代指标。(4)远隔缺血后处理时间(即每次时间×次数)与室性心律失常、cTnT的水平、心肌梗死面积相关性。

2 结 果

2.1室性心律失常评分 室性心律失常主要发生于缺血及再灌注后前30 min内，其评分结果见图1。假手术组实验前后无变化；在再灌注后0～30 min，B、D组与A组比较，再灌注室性心律失常评分差异无统计学意义(P>0.05)；C、E组与A、B、D组比较差异有统计学意义(P<0.01)。再灌注31～60 min，E组与A、B、C、D组比较，再灌注室性心律失常评分差异有统计学意义(P<0.01)，A、B、C、D组无差异。此后各组间室性心律失常评分比较差异无统计学意义(P>0.05)。且心律失常评分与缺血后处理时间呈负相关(r=-0.892)。

图1 室性心律失常评分情况

2.2血浆cTnT水平比较 假手术组实验前后无变化；与A组比较，B、C、D、E组下降显著(P<0.05)。与B、C、D组比较，E组下降显著(P<0.05)，见表1。且cTnT水平与缺血后处理时间呈负相关(r=-0.833)。

2.3心肌梗死面积 以cTnT总释放量曲线表示，见图2。假手术组无心肌梗死； 与A组比较，B组下降32.3%，C组下降32.8%，D组下降31.0%，E组下降35.8%。且心肌梗死面积与缺血后处理时间呈负相关(r=-0.782)。

表1 5组血浆cTnT水平比较

图1 5组cTnT总释放量曲线

3 讨 论

随着冠状动脉再血管化介入(PCI)治疗方法、冠状动脉搭桥术(CABG)、瓣膜置换术等技术推广应用，再灌注损伤造成心肌损伤已被临床医生所认识和关注。探索激发机体内源性保护机制减轻缺血及再灌注损伤成为心血管领域的研究热点。

2003年Zhao等[2]首次发现后适应在限制梗死范围及保护缺血后的内皮功能方面与缺血预适应有相同效果，并提出缺血后适应(ischemic postconditioning，IPOC)概念。由于IPOC实施对心脏具有侵袭性，存在不可预知的风险，后提出远程缺血后适应(remote ischemic postconditioning，RI-PostC)。目前对IPOC研究主要集中在实施方案上，包括再灌注/闭塞的循环次数和每次循环的时间。多数学者的共识是循环次数3～6次，单次循环的时间10～30 s对心脏保护作用可以肯定[4]。对RI-PostC的实施方案还不明确，Andreka等[5]发现对猪心肌梗死模型采用肢体RI-PostC(缺血5 min再灌注5 min，4个循环)心肌梗死面积减少约22%，肌酸激酶(CK)的释放减少约26%。Mei等[6]研究发现，早期给予无创肢体缺血后适应(RPOC)能减少梗死面积，而反复肢体RI-PostC(每天1次或每3天1次)减轻左室重塑，且1次单项后处理可提高生存率。甚至还有研究表明，RI-PostC给予3轮上肢缺血5 min，再灌注5 min可减少PCI术后24 h cTnI 中位数值，且降低6个月不良心脑事件发生率[7]。也有研究揭示远隔缺血后处理和预处理对人体血管内皮功能保护作用与远隔缺血刺激强度相关[8]。本研究发现，双侧股动脉实施3次缺血10 min再灌注5 min及4次缺血10 min再灌注5 min，明显减少再灌注前30 min心律失常发生，且4次缺血10 min再灌注5 min优于3次缺血10 min再灌注5 min及4次缺血5 min再灌注5 min。不同的是，双侧股动脉实施2个循环缺血5 min再灌注及4次缺血5 min再灌注对室性心律失常发生无明显抑制作用，且室性心律失常发生与后处理时间长短呈负相关。也有报道，在冠状动脉开放同时实施短暂肢体缺血触发远隔缺血后处理未能对再灌注期室性心律失常产生显著抑制作用[9]。产生这种不同结果的解释是，再灌注心律失常主要发生再灌注前30 min，而远隔缺血时间过短(缺血再灌注循环次数少)或强度不够(每次阻断血流时间过短)不足以诱导保护作用。

心肌梗死患者的预后与心功能明显相关，梗死面积决定心功能分级。Han等[10]研究表明，RI-PostC(再灌注同时，立即在后肢双侧动脉行缺血5 min再灌注5 min，3个循环)，可降低CK、cTnI，降低左室舒张末压(LVEDP)和左室收缩压(LVSP)。Xin等[11]研究提示，给予4次缺血5 min再灌注5 min后处理使梗死面积降至(29.39±3.66)%，而预处理则使梗死面积降至(33.49±5.81)%。但也有研究发现远隔缺血预处理不能减少cTnI下降，也不能提高血流动力学[12]。本研究发现，双侧股动脉实施缺血再灌注者均有cTnT血浆浓度较对照组显著下降，且实施4个循环缺血10 min再灌注，优于2个循环缺血5 min、10 min再灌注及3个循环缺血10 min再灌注者。心肌梗死面积，与A组比较，B组下降32.3%，C组下降32.8%，D组下降31.0%，E组下降35.8%，且与后处理时间长短呈负相关。但与既往研究结果相比有差异，Kerendi等[13]报道在鼠心肌缺血再灌注前结扎肾动脉5 min，心肌梗死面积减少50%；RI-PostC对心肌保护作用的差异可能与动物种属和实验方案及参考标准不同有关，其作用机制还不太明确，根据国内外的研究报告，目前主要包括以下几个方面：(1)内源性腺苷释放及腺苷受体激活[14]；(2)短暂感受器电位胡椒素1(TRPV1)、心脏及循环中主要神经肽、降钙素相关肽(CGRP)和P物质(SP)释放增加[15]；(3)抑制羟基自由基释放[16]、开放ATP敏感性钾通道及抑制线粒体通透性转换孔[17]，通过再灌注损伤补救激酶(RISK)信号通路激活丝氨酸/苏氨酸激酶(AKT)及存活刺激因子提高(SAFE)通路激活信号转导和转录激活因子3(STAT3)等[11]。最近有研究表明，阿片受体在远隔缺血预处理的心肌保护作用机制中占有重要地位[18]。但具体作用机制还有待于进一步研究。

本实验显示，肢体远隔缺血后处理对心脏的保护作用与缺血再灌注的时间呈负相关，选择兔下肢作为远隔缺血处理对象，操作简单且安全，为在临床中的应用提供一些依据。

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