高压氧结合电针治疗对脊髓损伤后大鼠膀胱功能的影响

王晓红，邵 彬，黄礼群

(广州军区武汉总医院康复理疗科，武汉 430070)

脊髓损伤(spinal cord injury，SCI)可引起下尿路排尿功能障碍(神经源性膀胱)，严重时可伴发致死性尿路感染或慢性肾衰竭[1]。临床实践已证实高压氧是治疗SCI的重要方法，但高压氧治疗神经源性膀胱的机制尚不清楚，其可能的机制是高压氧可以保护神经细胞，促进神经纤维再生[2]，从而诱发或重建正常的排尿反射；电针可以通过多环节延缓和减轻SCI的程度，改善损伤后并发症[3]，同时大量临床实践也证实电针在改善SCI后排尿功能方面具有独特疗效[4-5]，本文旨在观察高压氧结合电针治疗对SCI后大鼠膀胱功能的影响，从而为临床治疗SCI后神经源性膀胱提供一定的实验依据。

1 材料与方法

1.1材料 实验动物为健康雌性SD大鼠60只(鼠龄 4～6周)，体质量250～350 g，按随机数字表法分为3组：对照组、高压氧组和高压氧结合电针组(结合电针组)，每组20只；各组又按手术后相应时间点分为24 h，3 d、7 d、14 d组，每组5只。实验动物由广州军区武汉总医院医学实验中心提供，饲养温度为20～23 ℃，湿度为50%～60%，大鼠在笼内自由进食饮水。

1.2方法

1.2.1实验动物模型制备 采用Allen′s 重物撞击法制造大鼠SCI模型。称取大鼠体质量后，给予10%水合氯醛溶液按4 mL/kg腹腔内注射麻醉，然后用电子剃毛器剃去大鼠背部毛发，以T12为中心显露直径约为0.5 cm的圆形无菌区，作为SCI区。将大鼠固定在鼠台上，以T12棘突为中心背部正中纵行切口，长约3 cm，显露脊柱后，在T11～12间用血管钳小心咬除棘突和双侧椎板，露出白色的脊髓后，用致伤量为50 g/cm2的Allen′s重物撞击法损伤脊髓，大鼠的双下肢出现回缩性扑动、尾巴呈痉挛性摆动后双下肢瘫痪，表明造模成功，然后依层次缝合。术后给予青霉素腹腔注射预防感染。所有大鼠均接受Allen′s 重物撞击法制造SCI模型，造模成功后12 h按不同组别给予相应治疗，其中对照组不接受任何治疗，高压氧组仅接受高压氧治疗，结合电针组接受高压氧及电针治疗。

1.2.2高压氧治疗 高压氧组及结合电针组大鼠于术后12 h进舱，先用纯氧洗舱10 min ，使舱内氧浓度大于95%，20 min内缓慢加压至0.25 MPa。在高压下停留60 min，其间用纯氧通风10 min，停留结束后在20 min内匀速减压至常压，结束治疗。高压氧治疗每天1次。

1.2.3电针治疗 结合电针组大鼠于高压氧治疗后开始电针治疗，电针治疗参数：输出电压4～6 V，疏波4 Hz，密波20 Hz，留针20 min，每天1次。取穴及针刺方法[6]：大椎穴，背中线上，C7与T1棘突间，顺棘突间直刺5 mm；肾俞穴，L2棘突下两旁，直刺6 mm；三阴交穴，后肢内踝尖直上10 mm，直刺5 mm。

1.2.4尿流动力学检查 大鼠称体质量后，先以25%乌拉坦按1.0 g/kg腹腔注射麻醉[7]，30 min后经尿道插入3号输尿管导管，将大鼠放入测压笼内，设置室温为30 ℃。输尿管导管接上三通，用注射器抽出膀胱内尿液后，三通一端与微量灌注泵相接，另一端接尿动力仪的膀胱压力传感器，体内置零。再以0.2 mL/min的速度向膀胱内灌注室温下生理盐水，至大鼠开始排尿时停止注水。测定排尿量，以1 mL注射器抽出膀胱内残余尿。连续测量3次。膀胱测量指标为膀胱容量(灌注速度×灌注时间)、排尿量、残余尿量(膀胱容量-排尿量)、排尿速率、最大排尿压。

1.2.5取材 分别在造模后24 h,3、7、14 d处死大鼠。处死前大鼠完成尿流动力学检测，检测后开胸暴露心脏，心脏灌注冰生理盐水至流出液为清亮后给予4%的多聚甲醛溶液继续灌注，灌注完成后取出受损脊髓节段头端3 mm、尾端3 mm的脊髓组织，及大鼠膀胱标本放入相同灌注液中，置入4 ℃冰箱过夜。乙醇脱水石蜡包埋并切片，其中脊髓切片为头端5 μm，尾端5 μm各一张。

1.2.6神经型一氧化氮合酶(Neuronal nitric oxide synthase，nNOS)表达检测 根据GENE TECH 公司两步法抗兔/鼠通用型免疫组化试剂盒说明书进行，石蜡切片置于65 ℃烘箱中，烘片2 h，脱蜡至水，用PBS(pH 7.4)冲洗3次，每次5 min；高压热修复：在沸水中加入Na2EDTA(pH 9.0)。盖上不锈钢锅盖，但不能锁定。将玻片置于金属染色架上，缓慢加压，使玻片在缓冲液中浸泡5 min，然后将盖子锁定，小阀门将会升起来。10 min后除去热源，自然冷却。切片放入3%过氧化氢溶液，室温下孵育10 min，以阻断内源性过氧化物酶。PBS(pH 7.4)冲洗3次，每次5 min；甩去PBS液，第一抗体1∶100浓度稀释。每张切片加入50 μL稀释液，4 ℃过夜；PBS冲洗3次，每次5 min；甩去PBS液，每张切片加50～100 μL A液(ChemMateTMEnVision+/HRP)，室温下孵育45 min；PBS冲洗3次，每次3 min；甩去PBS液，每张切片加50～100 μL新鲜配制的DAB溶液，室温下孵育5 min，显微镜控制显色；显色完全后，蒸馏水或自来水冲洗，苏木素复染，0.1%盐酸分化，自来水冲洗，PBS冲洗返蓝；切片经过梯度乙醇(70%～100%)脱水干燥，二甲苯透明，中性树胶封固；用PBS代替一抗做阴性对照，高倍视野(×400)下计算阳性细胞率，即每张切片随机取出10个不重叠高倍视野，算出阳性细胞率。

2 结 果

2.1nNOS在脊髓及膀胱组织中的表达 在各时间点上，对照组、高压氧组及结合电针组的脊髓及膀胱组织中均有表达(封2图1)，阳性细胞即为细胞质内棕黄色染色颗粒；免疫组化结果显示，在各时间点上，高压氧组及结合电针组nNOS阳性细胞表达均高于对照组(P<0.01)，结合电针组的阳性细胞数显著高于高压氧组(P<0.05)，见表1。

2.2尿流动力学分析 尿流动力学结果显示，对照组、高压氧组及结合电针组尿流动力学指标在术后24 h比较，差异无统计学意义(P>0.05)；术后3 d及以上，高压氧组及结合电针组各项尿流动力学指标均优于对照组，差异有统计学意义(P<0.05)；术后7、14 d，结合电针组的尿流动力学指标明显优于高压氧组，差异有统计学意义(P<0.05)，见表2。

表1 nNOS在脊髓及膀胱组织中阳性细胞率的表达±s，%)

表2 各组尿流动力学的影响±s)

续表2 各组尿流动力学的影响±s)

3 讨 论

由于控制膀胱的中枢或周围神经伤病所引起的排尿功能障碍，称为神经源性膀胱，它是SCI的常见合并症之一[8]。神经源性膀胱引起严重尿潴留、尿路感染、膀胱内高压、膀胱-输尿管反流，甚至发生慢性肾衰竭，是截瘫患者的首位死亡原因。1987～1988年，中国康复研究中心对唐山地震后因SCI造成截瘫死亡的374例患者进行调查，发现肾衰竭占死因的40%以上。

国内外研究表明，氮能神经递质合成减少在神经源性膀胱发病过程中起重要作用。由于一氧化氮(nitric oxide,NO)的化学性质极不稳定，目前主要是通过检测一氧化氮合酶(nitric oxide synthase,NOS)及其降解产物的含量间接了解NO的变化。NOS阳性神经纤维广泛分布于膀胱及尿道组织，NO通过NO-cGMP信号途径舒张下尿路平滑肌，降低正常排尿时的尿道压，对维持正常的膀胱储、排尿功能有重要意义[9-11]。敲除nNOS基因的小鼠膀胱-尿道括约肌功能紊乱，有排尿困难、尿频等症状[12]。神经源性膀胱逼尿肌、膀胱颈平滑肌中氮能神经递质含量明显下降,从而使逼尿肌兴奋性升高，膀胱收缩与舒张功能失调，导致排尿障碍[13]。国内研究报道电针治疗使SCI后大鼠膀胱逼尿肌及膀胱颈平滑肌中nNOS 表达增加，从而改善大鼠排尿功能[14-15]；高压氧治疗可以促进损伤后脊髓的神经细胞再生[16-17]，在本文的前期研究中，发现高压氧能够显著减少SCI大鼠神经元细胞凋亡的同时，还能改善SCI大鼠的肢体功能及行为学评分[18]。

本实验结果表明，在术后各时间点上，高压氧组及结合电针组nNOS阳性细胞表达均高于对照组(P<0.01)，结合电针组的阳性细胞数显著高于高压氧组(P<0.05)；术后7、14 d，结合电针组的尿流动力学指标明显优于高压氧组，差异有统计学意义(P<0.05)，说明高压氧及电针治疗都能改善SCI后大鼠尿流动力学指标，且都与脊髓及膀胱组织中氮能神经递质的合成与释放增加有关。所以本研究认为高压氧与电针相结合治疗SCI后神经源性膀胱，能够更好地改善SCI后大鼠的膀胱功能。其机制可能是：(1)高压氧能明显增加损伤脊髓组织氧张力，调节微循环功能，减轻脊髓水肿，保护神经细胞，促进神经纤维再生，同时高压氧也能提高脊髓对缺氧的耐受性[19]，使脊髓神经元细胞缺血缺氧状态得到改善，继而使更多残存的神经细胞免于继发性损伤，更多地保留支配膀胱的神经功能。(2)中医认为SCI的病因病机是由于督脉受损，电针督脉(大椎穴)可以改善SCI局部组织的血液微循环，又能促进脑脊液流动，减轻SCI 部位的水肿和血肿的压迫及粘连，从而扼制了脊髓继发性损伤的进行[20]；三阴交是足三阴经交会穴，三阴经循行少腹或阴器，能通调下焦之气机，推测电针刺激通过反射弧到脊髓后根激发腰骶部排尿中枢，引起反射性排尿；肾俞穴内有第1、2腰髓侧角发出的交感神经纤维，可使尿道内括约肌收缩，而使膀胱容量增大，减少排尿次数。同时电针治疗具有清除自由基和抑制氧化应激反应的作用，从而提高氧化能力，改善急性SCI，这也可能是电针改善SCI作用途径之一[21]。(3)本实验数据表明，高压氧结合电针治疗使nNOS表达显著增加，使氮能神经递质合成增加，并使膀胱和尿道组织中抑制性神经递质水平升高，尿道及膀胱颈痉挛减轻，平滑肌舒张，尿道阻力降低，逼尿肌舒张，无抑制收缩频率减少，膀胱顺应性提高，由此改善大鼠尿流动力学指标，排尿障碍症状改善。总之，高压氧结合电针治疗对SCI后大鼠的神经元具有保护作用，并能很好改善大鼠的膀胱功能。

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