Tim-4基因rs7700944位点多态性与宁夏回族人群RA的关联性分析*

徐金瑞,杨 易,周 晶，孙晶莹

(宁夏大学西部特色生物资源保护与利用教育部重点实验室，银川 750021)

类风湿关节炎(rheumatoid arthritis，RA)属自身免疫性疾病，主要表现为关节滑膜慢性炎症性病变。在我国，RA患病率为0.3%，严重时会导致劳动力丧失或致残[1]。遗传与环境因素共同作用导致RA发生。双胞胎RA患病率高于普通人群，且RA具有轻度的家族聚集倾向，均表明遗传因素参与了RA发病[2]。2001年，McIntire等[3]在研究哮喘基因中发现一个新的基因家族，即T细胞免疫球蛋白域黏蛋白域蛋白(T cell immunoglobulin domain and mucin domain protein，Tim)。人类Tim基因位于5q33.2上，目前已确定有Tim-1，Tim-3及Tim-4 3个成员。Tim-4主要表达于成熟的树突状细胞、巨噬细胞的细胞膜表面[4]，通过与其受体Tim-1相结合发挥作用，促进Th2细胞的分化与增殖，对一些免疫性疾病产生调节作用[5]。由于历史上禁止与异族通婚，宁夏回族人群形成了遗传学上的“隔离人群”。已有研究表明，宁夏回族具有特殊的遗传结构，与汉族及其他民族间存在差异[6]。目前，国内外尚未见有关Tim-4基因多态性与RA关联性的研究报道。本研究对宁夏地区回族人群Tim-4基因rs7700944位点的多态性进行分析，探讨该位点的变异与宁夏地区回族人群RA发生的关联性。

1 资料与方法

1.1一般资料 根据知情同意原则，收集宁夏不同地区回族人群外周静脉血样本，RA患者210例，健康个体198名。个体间无血缘关系，追溯3代均为同一民族，且在宁夏居住3代以上。

1.2方法

1.2.1基因组DNA提取 采用常规的酚/氯仿提取法提取基因组DNA，并溶于TE缓冲液中备用。

1.2.2引物 参照GeneBank中Tim-4基因序列及相关文献设计合成引物，由上海生工生物工程技术服务有限公司合成，上游引物：5′-CTT AGC TGG CTT AGG AGT AGC-3′，下游引物： 5′-GGT CCA CGA TAA AGG AGA AA-3′。

1.2.3PCR反应 PCR反应体系25 μL：DNA模板(40 ng/μL)1 μL，引物P1、P2各1 μL，10×PCR缓冲液2.5 μL，dNTP(10 mmol/L)1 μL，Taq DNA聚合酶(1 U/μL)0.2 μL，Mg2+(25 mmol/L)1.5 μL，灭菌三蒸水16.8 μL。扩增程序为：94 ℃预变性5 min后进行30个循环，每个循环为94 ℃ 30 s，61 ℃ 30 s，72 ℃ 50 s。最后在72 ℃延伸10 min，4 ℃保存。取PCR产物3 μL，用1.5%琼脂糖凝胶电泳分离。

表1 两组rs7700944位点多态性分布[n(%)]

1.2.4限制性内切酶酶切 采用SacⅠ限制性内切酶(购自美国NEB公司)对PCR产物进行酶切，反应体系10 μL：PCR产物3.5 μL，10×酶切缓冲液1 μL，限制性内切酶2 U，用灭菌三蒸水补齐至10 μL。经37 ℃酶切2～3 h，产物经8%非变性凝胶电泳分离。

1.2.5基因型的记录与分析 各样本的基因型判定根据酶切结果：AG为298、200、98 bp，GG为：200、98 bp，AA为298 bp。

1.3统计学处理 采用SPSS17.0软件进行统计分析，基因型频率、等位基因频率在两组中频率分布的差异及Hardy-Weinberg平衡检验均采用χ2检验，以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1PCR结果 扩增出的目的片段大小为298 bp，见图1。

2.2酶切结果 rs7700944位点检出3种基因型：GG，AA和GG，见图2。

M：DNA标记物；1～5：PCR产物。

M：DNA标记物；1、3、4:基因型GG；2:基因型AA；5:基因型AA；P：PCR 产物。

2.3基因型与等位基因频率 由表1可见，rs7700944位点基因型频率及等位基因频率在宁夏回族人群RA组与对照组比较，差异有统计学意义(χ2=29.051、14.106，P<0.01)。等位基因A在对照组中的频率高于RA组，OR(95%CI)为0.549(0.400～0.752)，而等位基因G在对照组中的频率低于RA组，OR(95%CI)为1.823 (1.330～2.498)(P<0.01)。

3 讨 论

以往研究表明，Tim基因多态性与多种疾病的发生相关，因此，可根据其基因型预测个体对自身免疫性疾病的易感性[7-9]。Chae等[10]研究发现，Tim-1基因在启动子区和编码区共有10个单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphisms,SNPs)的变异与韩国人群哮喘的发生显著相关。Khademi等[11]发现，由Th1和Th2细胞介导的疾病与Tim蛋白的参与具有一定关联性。王长青等[12]研究发现，Tim-3基因启动子区2574 G>T的变异可能与山西汉族人群变应性鼻炎易感性有关。张才成等[13]研究了Tim-3基因启动子区-1541和-574、4259位点的变异，发现4259 T>G与湖北汉族人RA易感性有关。有研究表明，Tim-3基因-1541 C>T、4259 G>T的变异及Tim-1基因-232 A>G、-1637 A>G的变异与宁夏回族RA的发生有关[14-15]。

本研究首次对宁夏回族人群Tim-4基因多态性与RA发生的关联性进行了研究。结果表明，rs7700944位点基因型频率及等位基因频率在宁夏回族人群RA组与对照组间，均存在极显著的差异。等位基因G为宁夏回族人群易患RA的风险因子，而等位基因A为保护因子。

rs7700944位点是位于Tim-4基因内含子5中G>A的突变，该突变是否通过影响Tim-4基因的表达，从而对免疫相关疾病产生间接影响，尚需进一步研究证实。

本研究结果对宁夏回族RA的早期预防提供了参考数据，并可为今后进一步开展该基因与其他疾病的相关性奠定了基础。

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