一株罗伊氏乳杆菌的生物学特性研究

邵景海，杨郁荭，李亮，韩迪，赵霞，方曙光

（1.完达山乳业股份有限公司，哈尔滨 150000；2.润盈生物工程（上海）有限公司，上海 710021）

一株罗伊氏乳杆菌的生物学特性研究

邵景海1，杨郁荭1，李亮2，韩迪2，赵霞2，方曙光2

（1.完达山乳业股份有限公司，哈尔滨 150000；2.润盈生物工程（上海）有限公司，上海 710021）

研究了一株完达山乳业和润盈生物菌种研究项目组分离的罗伊氏乳杆菌LR-G100的耐胃酸、耐胆盐、降胆固醇和抑制肠道有害菌的生物学特性。结果表明，罗伊氏乳杆菌在pH值为2.5～4.5条件下，具有较强的生存能力；在胆盐质量分数为0.1%～0.5%环境中，活菌数能保持在106mL-1以上；在反应16 h后，同化胆固醇百分率能达到50%以上；对肠道有害菌的抑制效果也非常显著。

罗伊氏乳杆菌；生物学特性；降胆固醇；抑菌

0 引言

罗伊氏乳杆菌是益生菌中具有代表性的典型菌属，具有降胆固醇，改善和调节肠道菌群平衡，提高机体免疫力的功能[1]。本实验菌株罗伊氏乳杆菌LRG100，完达山乳业和润盈生物菌种研究项目组分离筛选自高加索自然发酵的酸奶中。研究表明，益生菌能发挥保健功能，前提条件之一，是到达人体肠道的活菌数应在106cfu/mL以上[2]。人体胃肠为高酸、高胆盐环境，罗伊氏乳杆菌进入人体后，能否顺利通过胃肠道环境，是决定其发挥保健功能的关键因素所在。本实验研究了罗伊氏乳杆菌LR-G100的生长特性，对胃酸、胆盐的耐受性，降胆固醇特性以及抑菌特性，以期为罗伊氏乳杆菌的益生作用提供理论依据，进而为其保健功能的的开发奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料

菌种：罗伊氏乳杆菌（编号为LR-G100），此菌株分离于长寿地区高加索山脉的酸奶，菌株编号为LR-G100，经中国科学院微生物研究所鉴定为罗伊氏乳杆菌。

培养基：MRS培养基，营养琼脂培养基，Skirrow氏培养基等，121℃灭菌20 min。

主要仪器：DHP-9082型培养箱，WFZ UV-2102型紫外可见分光光度计，LDZX-50KBS立式压力蒸汽灭菌锅，苏州佳宝JB-VS-1300U型洁净工作台等。

1.2 方法

（1）菌株鉴定。经过生理生化初步确定后，再经过16s RNA提取扩增测序，并在NCBI比对，做菌种鉴定。

（2）产酸和生长动力学。将LR-G100活化18 h后，采用2%接种量，接种于12%全脂奶粉复原乳中，37℃恒温培养，在培养的第0～18 h内，每隔1 h取样，测酸度及活菌数。采用0.l mol/L的氢氧化钠溶液滴定酸度(oT)，活菌计数采用倾注平板计数法[3]。

（3）耐酸测试。用浓度为0.1 mol/L的HCl将MRS液体培养基pH值，分别调为1.5，2.5，3.5，4.5；115℃灭菌15 min，冷却，无菌条件下接种质量分数为2%的LR-G100种子液，于37℃恒温培养，在培养的0～6 h内每隔1 h取样计活菌数。

（4）耐胆盐实验。用猪胆汁盐将MRS液体培养基的胆汁盐质量分数，分别调为0.1%，0.2%，0.3%，0.4%；115℃灭菌15 min，冷却，无菌条件下接种2%的LRG100种子液，于37℃恒温培养，在培养的0～5 h内每隔1 h取样计活菌数。

（5）同化胆固醇能力测定。采用比色法来测定LR-G100对胆固醇的同化效果[4]。

（6）抑制胃肠致病菌测定。采用单层琼脂扩散法[5]，测定LR-G100对大肠杆菌和幽门螺旋杆菌的抑菌效果，以抑菌圈直径作为抑菌效果的指标。

2 结果与分析

2.1 罗伊氏乳杆菌16sRNA鉴定

经过16sRNA提取扩增测序，并在NCBI做序列比对后，鉴定为罗伊氏乳杆菌，具体序列如下：

2.2 产酸和生长动力学测定

在质量分数为12%全脂奶粉复原乳中，接入质量分数为2%的LR-G100种子液，于37℃恒温培养，其产酸和活菌数变化如图1和图2所示。由图2和图3可以看出，发酵10 h时，发酵复原乳酸度达到67oT，活菌数维持在3.1×108mL-1的水平。

2.3 耐酸性能测定

LR-G100在不同pH值的灭菌MRS液体培养基中,活菌数变化如表1所示。由表1可以看出，在pH值为4.5条件下，LR-G100活菌数呈现增加趋势，即使在pH值为2.5条件下，4 h的活菌数仍达到106mL-1，而在pH值为1.5以下，经过4 h培养后大部分罗伊氏乳杆菌死亡，但在培养2 h后的活菌数仍能达到105mL-1，表明LR-G100耐酸性极优，可通过胃的强酸环境。

表1 LR-G100在不同pH值条件下的活菌数变化状况

2.4 耐胆盐性能测定

LR-G100在不同胆盐浓度的灭菌MRS液体培养基中,活菌数变化如图3所示，虽然在0.4%胆盐培养基中培养2 h时LR-G100活菌数有所下降，但6 h后仍能维持在106mL-1以上，这表明LR-G100在0.1%～0.4%胆盐质量分数下耐受性极优。也说明LR-G100能够通过小肠到达大肠，可以充分发挥其益生作用。

2.5 同化胆固醇能力测定

通过测定罗伊氏乳杆菌发酵乳中,胆固醇的吸光度的变化，可以确定LR-G100对胆固醇的同化效果，结果如表2所示。由表2可以看出，LR-G100在16 h对胆固醇的同化率达到50%以上，且同化率随着时间延长呈上升趋势，这说明LR-G100有较好的同化胆固醇的能力。

表2 LR-G100同化胆固醇的能力

2.6 对胃肠致病菌的抑制作用测定

平板抑菌实验显示，LR-G100对大肠杆菌的抑菌圈直径都在11 mm以上，平均在11.5 mm(见图4)，大于一般乳酸菌对大肠杆菌的抑制圈直径（7～10 mm）；LR-G100对幽门螺旋杆菌的抑菌圈直径在10 mm以上，平均在11.5 mm(见图5)，大于一般的乳酸菌对幽门螺旋杆菌的抑制圈直径（5～7 mm），此结果表明，LRG100能有效地抑制或杀死大肠杆菌和幽门螺旋杆菌。

3 结论

综上所述，从俄罗斯高加索地区自然发酵酸奶样中，分离和鉴定出的一株罗伊氏乳杆菌LR-G100，具有优良的益生菌生物学特性，在模拟胃肠环境条件下，具有较强的耐酸、耐胆盐能力，绝大多数能通过肠胃到达肠道，降解胆固醇效果明显，并能抑制有害菌，起到调节肠道菌群的作用，可适合添加于功能型益生菌酸奶或发酵乳饮品中。在瑞士和日本，罗伊氏乳杆菌已经在许多功能性食品中得到应用。随着国内对罗伊氏乳杆菌研究的不断深入，该菌在乳制品行业，以及食品行业的应用领域和使用方法也会不断扩大，这也是我国益生菌产业的发展趋势和必然结果。

[1]庞洁,周娜,刘鹏,等.罗伊氏乳杆菌的益生功能[J].中国生物工程杂志,2011,31(5):131-137.

[2]GISMONDO M R,DRAGO L,LOMBARDY A.Review of Probiotics Available to Modify Gastrointestinal Flora[J].International Journal of Antimicrobial Agents,1999,12:287-292.

[3]杨洁彬,兴华,代文.乳酸菌—生物学基础及应用[M].北京:中国轻工业出版社,1991:1-3.

[4]赵瑞香,孙俊良,李明静,等.嗜酸乳杆菌同化MRS培养基中胆固醇能力的研究[J].Chinese Journal of Micro ecology,2005,17(8):254-255.

[5]李正华.罗伊氏乳杆菌生物学特性及功能性发酵乳的研究[D].无锡:江南大学,2003.

Phenotype investigation on a strain of lactobacillus reuteri

SHAO Jing-hai1，YANG Yu-hong1，LI Liang2，HAN Di2，ZHAO Xiao2，FANG Shu-guang2
（1.Wondersun Dairy Company,Harbin 150000，China；2.BioGrowing Co.Ltd.,Shanghai 710021，China）

The phenotype characteristics:survivability to gastric acid and bile salt,capacity of cholesterol assimilation,and anti-microbial effect to pathogenic bacteria,of a strain ofLactobacillus reuteriLR-G100,were investigated.The result shows that this strain has strong survivability under pH 2.5～4.5,and the vial cell number maintains above 106cfu/mL even when bile salt concentration is 0.1%～0.5%.This strain has distinct anti-microbial effect to enteropathogenic bacteria,and the capacity(%)of cholesterol assimilation could reach 50%after 16 hrs of reaction.

Lactobacillus reuteri；phenotype characteristics；cholesterol assimilation；anti-microbial

Q936

A

1001-2230（2012）03-0028-03

2012-01-20

邵景海（1975-），男，食品高级工程师，研究方向为乳制品加工。