试剂盒法测定乳粉中的维生素

王旻

（1.东北农业大学，哈尔滨 150030;2.黑龙江省乳品工业技术开发中心，哈尔滨 150086）

试剂盒法测定乳粉中的维生素

王旻1,2

（1.东北农业大学，哈尔滨 150030;2.黑龙江省乳品工业技术开发中心，哈尔滨 150086）

通过对国家标准GB 5413-2010和德国拜法公司微生物法测维生素试剂盒说明书的研究，做对比试验，两种检测方法差异率小于10%。找出试剂盒标准曲线的实际质量分数，绘制出标准曲线，定出实验室适用的试剂盒方法。

微生物法,检测；维生素；试剂盒

0 引言

微生物法测定食品中的维生素，源于美国官方分析家协会手册（AOAC）[1]。鉴于国标修改需要大量的数据支持，所以新国标GB5413-2010也是等同采用AOAC方法只是格式和适用条件变化一些。该方法多年来原理未改动，虽然有这样或那样的自动化测定设备的改进，但都操作复杂，成本高，对人员、器皿清洗要求高。受德国必发公司的试剂盒方法启示，本文也研究了利用试剂盒测定乳粉中的维生素。

1 实验

1.1 材料

不同种类奶粉及米粉，96微孔板(NUNC灭菌)，1.5 mL微型离心管(microtube),0.22 μm滤膜（密理博）, 5 mL注射器,维生素B12测定培养基（Difco）,生物素测定培养基（Difco）,叶酸测定培养基（Difco）,,乳酸杆菌琼脂培养基（Difco），乳酸杆菌肉汤培养基（Difco）。

1.2 菌株

（1）维生素B12测定用菌种：莱曼氏乳杆菌（Lactobacillus leichamanni）(ATCC7830)

（2）生物素测定用菌种：植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum）(ATCC8014)

（3）叶酸测定用菌种：干酪乳杆菌（Lactobacillus casei）(ATCC7469)

菌株来源于美国标准菌种保藏中心（ATCC），现保存于东北农业大学。

1.3 主要设备

电热灭菌压力锅，超纯水机，pH计，生化培养箱，微孔板判读仪(540～550nm或610～630nm)，离心机，水浴锅。

1.4 方法

1.4.1 测试菌株的制备

从冷藏的乳酸杆菌琼脂培养基接种管中接种一管乳酸杆菌肉汤培养基37℃培养24 h在无菌条件下离心该培养液10 min（2 000 r/min），倾去上清液，再用10 mL生理盐水振荡洗涤菌体，再离心10 min（2 000 r/min），倾去上清液，再用另外的10 mL生理盐水清洗。如前面一样离心，弃去上清液，再加10 mL生理盐水。吸1 mL该菌悬液于10 mL生理盐水中，混合均匀。莱曼氏乳杆菌（Lactobacillus Leichamanni）用于维生素B12测定；干酪乳杆菌（Lactobacillus Casei）用于叶酸测定；植物乳杆菌（Lactobacillus Plantarum）用于生物素测定[1-2]。

1.4.2 样本处理

（1）维生素B12和生物素测定。称取1 g样品(维生素B12含量大约0.01 μg；生物素含量大约0.3 μg)加入40 mL水，在水浴锅中90℃保持30 min，冷却至室温后吸取1 mL到1.5 mL离心管中，用0.22 μm滤膜过滤除菌[2]或者在灭菌压力锅中，加热到115℃保持10 min。然后用蒸馏水稀释到适宜的倍数。然后用加样枪加150 μL到微孔板中和等量的已混入适宜浓度菌液的维生素B12或生物素测定培养基混合[7-8]。

（2）叶酸的测定。磷酸缓冲溶液的配制：7.8 g磷酸氢二钠和1 g抗坏血酸溶于1 000 mL用40%氢氧化钠溶液调pH值至7.2。称取1 g样品(叶酸含量大约0.5 μg)加入40 mL磷酸缓冲溶液，在水浴锅中90℃保持30 min，冷却至室温后吸取1 mL到1.5 mL离心管中，用0.22 μm滤膜过滤除菌[3]或者在灭菌压力锅中，加热到115℃保持10 min。然后用蒸馏水稀释到适宜的倍数。然后用加样枪加150 μL到微孔板中和等量的已混入适宜浓度菌液的叶酸测定培养基混合[6]。

1.4.3 标准溶液的制备

建立小鼠肝转移模型［11］，动物实验结果显示，在miR-454-3p mimics转染组中，小鼠的肝转移灶数量显著高于阴性对照组。小鼠的肝转移灶为箭头所指示处，统计发现组间差异显著，具有统计学意义（P＜0.05，图5）。

(1)维生素B12标准溶液。维生素B12标准曲线上5个点的质量分数分别为0.03%，0.06%，0.12%，0.18%。

(2)生物素标准溶液。生物素标准曲线上5个点的质量分数分别为0.08、0.24%，0.40%，0.56%，0.72%。

(3)叶酸标准溶液。叶酸标准曲线上5个点的质量分数分别为0.18%，0.32%，0.64%，0.96%，1.28%。

1.4.4 培养

每孔先加入150 μL混入菌液的培养基，然后分别加入150 μL样品和标准曲线溶液到试剂盒中。试剂盒放入（36±1）℃的恒温培养箱避光培养24～48 h[6-8]。

1.4.5 测定

测定前反复翻转试剂盒混匀样液。酶联免疫测定仪波长设定到630 nm[2]，振荡5 s，读取每孔的数值（吸收值A）。

2 结果与讨论

2.1 结果

曲线吸收值×稀释倍数×100维生素质量分数=样品质量

式中：曲线吸收值需分别从下面三项标准曲线中查出。曲线横坐标X轴表示维生素质量分数单位是μg/ 100 g；纵坐标Y轴表示酶联免疫读数仪读取微孔板样品的光密度（浊度）A值。%图1为维生素B12标准曲线；图2为生物素标准曲线；图3为叶酸标准曲线。4种乳粉中维生素B12质量分数、生物素质量分数、叶酸质量分数可以从标准曲线图1～图3中查出。

分别用试剂盒法和国标法测试4种不同类型的某品牌奶粉。国标法由于样品处理步骤较多请详见标准GB 5413-2010[3-5]。3项结果如表1～表3所示。

表1 维生素B12计算结果μg/100g

表2 生物素计算结果μg/100g

表3 叶酸计算结果μg/100g

2.2 讨论

从测定结果看，试剂盒方法比国标方法略高一些。这是由于前处理方法不同引起的，国标方法121℃，5 min灭菌，同时也是现有条件决定的。如果采取115℃灭菌可能后期培养过程中会被杂菌干扰，标线和样品管会没有生长梯度。试剂盒方法用115℃，10 min灭菌，也能达到无菌水平，培养24～48 h对目标菌没有影响。由于所测奶粉类样品多数是强化维生素，其所含有的内源天然维生素含量较低与后强化的维生素含量比较比例很低。国标方法用酸或酶水解目的就是水解样品中的天然维生素，而试剂盒方法没有，但从实测结果看影响不大。国标方法源于AOAC方法，而AOAC方法适用更广泛食品类样品，本文所讨论的乳粉类样品用此试剂盒方法是适用的。

（1）节省成本。试剂盒方法由于培养基用量较少可以预先把适宜浓度菌液混入测定培养基混匀，比国标方法逐管加菌液要均匀、省力、省时、合理，而且减少污染的几率，提高实验成功率。微生物法测维生素所用的测定培养基，都是国外质量过关稳定的产品，国内有资质的实验室都选用进口产品，但是其价格高昂。例如叶酸项目所用的叶酸酪蛋白培养基一瓶重量100 g，每9.4 g配制100 mL溶液，价值1 000元左右。按照国标方法，每个样品用12个试管，每管5 mL计算只能作17个样品，这还不包括标准曲线所用的量。试剂盒方法每孔只用150 μL，每个样品只用三孔或二孔作平行，每瓶培养基能作2364个样品。由于所加样液很少在稀释的过程中可用一次性1.5 mL的离心管和加样枪替代体积较大的容量瓶、试管和移液管等，既节省了纯水有节省了人工。现在一小时可以完成国标法8 h的工作量。

（2）测定时间。国标方法所用的光密度法如果用分光光度计测8 h可以测20个样品，即使用最先进的浊度测定仪也只能每次最多测12样品。试剂盒法所用的96孔板若加上标准曲线孔，最多可作26个样品，用酶联免疫读数仪几秒就可以读取所有数据。

3 结论

以国标方法为基准，试剂盒法与国标方法相比较，检测上述4种不同类型乳粉结果影响在合理范围而且大量节省试剂成本，节省人工劳动，大大缩短测定时间。所以差异率小于10%，方法可用。

[1]AOAC Official Method 944.12 Folic Acid(Pteroylglutamic Acid)in Vitamin preparations Microbiological Methods First Action 1944 Final Action 1960[S].

[2]AOAC Official Method 952.20 Cobalamin(Vitamin B12)in Vitamin Preparations Microbiological Methods First Action 1952 Final Action 1960[S].

[3]中华人民共和国国家标准GB 5413.19-2010食品安全国家标准婴幼儿食品和乳品中游离生物素的测定[S].

[4]中华人民共和国国家标准GB 5413.16-2010食品安全国家标准《婴幼儿食品和乳品中叶酸（叶酸盐活性）的测定》[S].

[5]中华人民共和国国家标准GB 5413.14-2010食品安全国家标准《婴幼儿食品和乳品中维生素B12的测定》[S].

Kit method for the determination of the vitamin in milk powder

WANG Min1,2
（1.Northeast Agricultural University，Harbin 150030,China 2.Heilongjiang Dairy Industry and Tecnology Developing Centre Harbin 150086,China）

Study methods of reference of P.R.China(GB5413-2010)and manuals of R-Biopharm of Germany.Compared to test two methods,Find the concentration of standards of kits and drawing the curve of standards.Work out the methods of kits for lab.

microbiological method；determination；Vitamin；kits

TS252.7

A

1001-2230（2012）03-0057-03

2012-01-10

王旻(1971-),男，硕士研究生，从事乳品检验方面的研究。