单抗免疫纳米粒的研究进展

郝蕾蕾，张典瑞

(山东大学 药学院 药剂教研室，山东 济南 250012)

单抗免疫纳米粒的研究进展

郝蕾蕾，张典瑞

(山东大学 药学院 药剂教研室，山东 济南 250012)

单抗免疫纳米粒的制备及分析评价方法的研究对于提高药物的主动靶向性、增强药物疗效、开发新剂型具有重要意义。本文对目前单抗与纳米粒的偶联技术、定性评价、存在的问题及改进方法等进行了总结和比较，为单抗免疫纳米粒这种新型药物载体的设计和应用提供参考。

单抗;免疫纳米粒;偶联技术

纳米粒(Nanoparticles)一般是指由天然或合成的高分子材料制成的粒度为纳米级(1～1 000 nm)的固态胶体微粒。单抗免疫纳米粒是指在偶联剂的作用下，将天然或修饰的单抗分子偶联到含有适当功能基因的纳米粒上。单抗免疫纳米粒具有靶向性强、毒副作用小、半衰期长、运载量大等优点。本文总结了单抗药物的研究现状，重点论述了单抗免疫纳米粒中单抗与纳米粒的偶联技术，同时进行比较分析并讨论了其定性评价及应用问题。

1 单抗药物的研究现状

单克隆抗体既可以单独作为药物也可以与药物形成免疫偶联物用于疾病的诊断和治疗，研究成果显著但应用上存在很多问题。目前被广泛研究的单抗免疫纳米粒能很好解决其不足之处并具有明显优势。单抗不同应用方式的优缺点如表1所示。

2 单抗免疫纳米粒的偶联技术

表1 单抗应用概况及优缺点比较

单抗与纳米粒偶联，既能发挥单抗的辨识和特异靶向能力，又能发挥纳米粒增强药物吸收和细胞内稳定性的能力，从而达到两者特性的联合［10］。单抗与纳米粒偶联有多种方式，其中非共价吸附和共价偶联的方式已被报道和应用，共价偶联包括非定向偶联和定向偶联。所选的偶联方式应具有特异性，不会引起广泛的交联，并能保证免疫纳米粒的稳定。

2.1 非共价吸附

非共价吸附必须要有适合的条件，吸附有两种方式:静电和疏水性相互作用。可通过控制基质的离子强度达到适合的pH值及带电情况来调节吸附行为。紫杉醇PLGA纳米粒带有负电荷，与用阳离子的多肽聚赖氨酸标记的抗体SM5-1通过静电相互作用制备免疫纳米粒，与未偶联单抗的紫杉醇PLGA纳米粒相比，其体外抗肝癌细胞系的毒性显著增强［11］。吸附是可逆非特异性反应，因而具有一些劣势:单抗必须要有较高的浓度;单抗在纳米粒表面是无方向、散乱排布的;由于非共价吸附不稳定，单抗能被其它生物分子所取代。对此，可以将纳米粒表面进行化学策略性修饰使单抗和纳米粒发生区域特异性相互作用来减少散乱性。

2.2 单抗与纳米粒非定向偶联

EDC(EDAC，乙基-二甲氨基-丙基碳化二亚胺)被用来形成各种化学偶联物，它能够和一个羧酸基团反应形成一个高活性的中间体O-acylisourea，这个活性中间体会继续和亲核基团如伯胺基发生反应形成酰胺键。EDC的优势就在于其水溶性，无需用有机溶剂溶解就可以直接加入到反应混合物中，很适用于连接生物活性分子。黄开红等［12］采用抗VEGF单抗与5-氟尿嘧啶(5-FU)聚乳酸纳米粒在EDC作用下通过化学键偶联方法制备了具有靶向功能的5-FU免疫纳米粒，其能显著提高肿瘤局部药物浓度，具有免疫导向和缓释药物双重活性功能。Xu等［13］用EDC作为交联剂合成了抗Her-2聚合物免疫荧光纳米粒，其能有效辨识卵巢癌细胞并具有灵敏度高、耐光性强等特点，为卵巢癌诊断提供了新的方式。

单抗可以借助共价反应不可逆地偶联到纳米粒上，形成的共价键稳定且重现性好，但必须确保单抗的生物活性不被影响。共价偶联相比于非共价吸附的优点是共价键阻止了单抗被血液中的成分竞争性取代，但具体哪个更好不能一概而论。例如:荧光染料标记的单抗PLGA免疫纳米粒能够识别乳腺癌细胞内高表达的细胞角蛋白，用于靶向侵入性上皮乳腺癌细胞。非共价吸附和共价偶联都被使用进行比较，通过细胞裂解物结合实验测定，只有非共价吸附的结合方式保留了识别能力，这可能是因为当肽类不带电的时候会导致溶解性差，从而发挥了更大的疏水特性可以和纳米粒的疏水性表面相互作用［14］。

在用EDC试剂进行的共价反应中，反应基团是氨基和羧基，但是这两个基团也存在单抗分子中，这可能导致单抗的自聚合作用而不是连接到纳米粒上。这些聚合了的单抗失去了特异性识别能力，不能用于药物靶向［15］。在抗原抗体结合区域内部的氨基基团也能被共价偶联影响，损害了其生物活性［16］。单抗直接共价偶联到纳米粒表面可能阻止了单抗的可接近性，也改变了纳米粒的表面特性，因此这不是一个最优的偶联反应。

2.3 单抗和纳米粒定向偶联

单抗和纳米粒定向偶联是指单抗通过Fc片段与纳米粒偶联，使其Fab片段的抗原结合位点在纳米粒表面定向朝外而有利于靶向。定向偶联很大的优势就在于每个纳米粒都具有较高的单抗负载量，单抗活性不会改变而且在高离子浓度的基质中保持稳定。单抗与纳米粒偶联的方法很多，连接分子如蛋白质A(从金黄色葡萄球菌细胞壁中分离得到的一种蛋白质)在很大程度上能减少立体阻碍而被广泛使用。当蛋白质A被吸附在纳米粒的表面后，它能特异性地和单抗的Fc片段相互作用使单抗很容易被偶联到纳米粒上，并通过Fab片段与特异性抗原结合。还可以使用一些醛类，环氧化物，硫醇等进行纳米粒表面的功能化，再用这些功能基团与单抗定向偶联。

Wagner等［17］用聚乙二醇-α-马来酰亚胺-ω-琥珀酰亚胺酯作为交联剂，交联剂一端和载有多柔比星的HSA纳米粒作用，另一端和被引入单抗DI17E6中的巯基反应从而使单抗和纳米粒共价偶联。该免疫纳米粒细胞毒性增强并可将多柔比星输送到αvβ3高表达的肿瘤细胞，是很有潜力的靶向传递系统。Marites等［18］首先将抗EGFR抗体用DTPA(二乙烯三胺五乙酸)及ATA(酰基化的硫代乙酸盐)进行修饰，然后在羟胺作用下暴露出游离巯基，最后与中空金纳米粒通过S-Au键结合得到稳定性良好的免疫金纳米粒，用于靶向EGFR高表达的癌细胞并经由辐射热效应将其杀灭。Liao等［19］用β-巯基乙胺将西妥昔单抗硫醇化，然后将其偶联到载有多柔比星和超磁性氧化铁(SPIO)的聚乙二醇-聚己内酯纳米粒上，该免疫纳米粒既可用作核磁共振成像的造影剂，又能有效传递多柔比星和SPIO到EGFR高表达的肿瘤细胞内并产生很大的杀伤效应，实现了诊断与治疗双重功能的联合。

定向共价偶联在增加单抗稳定性的同时能控制可利用的单抗偶联位点，是最佳的生物偶联方式。对于单抗的硫醇化需要注意的是:硫醇化时间越长，硫醇化试剂过量比例越大，发生单抗二聚化的可能性越大，这可能是在两个单抗分子间形成了二硫键所致。所以单抗硫醇化时间和硫醇化试剂加入量要合理设定才能保证单抗的硫醇化效果，从而保持单抗的活性。

2.4 多级共价偶联

多级共价偶联是以抗生物素蛋白-生物素相互作用为基础将单抗偶联到纳米粒表面的方法。Balthasar等［20］制备了免疫明胶纳米粒。首先，将功能化的巯基基团被引入到明胶纳米粒表面;然后，共价偶联NeutrAvidinTM(NAv)到硫醇化的纳米粒上得到NAv修饰的纳米粒;最后，NAv修饰的明胶纳米粒与生物素化的抗CD3抗体通过形成抗生物素蛋白-生物素复合物而共价偶联。该免疫纳米粒可以将药物特异靶向到T淋巴细胞，在淋巴细胞受体介导的细胞摄取方面显示出应用前景。

2.5 多重单抗与纳米粒偶联

多重单抗与纳米粒偶联能达到多种功能的联合而且每个单抗都以利于生物标记的方式定向排列在纳米粒表面，可用来合成多功能造影剂。例如:选择酰肼-聚乙二醇-二巯基化物作为连接子，连接抗肌动蛋白和抗生物素抗体到同一个金纳米粒上，肌动蛋白作为靶向抗体，生物素化了的TATHA2肽被连接到抗生物素抗体上以实现造影剂在细胞质的传递，利用PEG-SH来覆盖剩余裸露的金纳米粒表面以减少非特异性相互作用，同时聚乙二醇的亲水性也改善了免疫纳米粒的生物相容性［21-22］。Fujita等［23］将两个不同的单抗共价偶联到同一个聚苹果酸纳米粒上，一个是能引导偶联物通过血脑屏障的单克隆抗转铁蛋白受体抗体，另一个是能靶向肿瘤细胞表面核小体的单克隆抗体2C5，两种抗体的存在及生物活性都被ELISA证实，体内实验显示其在人神经胶质瘤中能够大量蓄积。多重单抗与纳米粒偶联需要注意多重单抗的比例选择，比例不同会很大程度地影响单抗在纳米粒表面的平均分布，从而影响其传递性与靶向性。

3 单抗免疫纳米粒的定性评价

3.1 免疫纳米粒偶联情况的测定

单抗是否偶联到纳米粒上，是通过共价偶联还是非共价吸附，偶联到纳米粒上的数量多少，这对于免疫纳米粒的成功构建及发挥特异性靶向作用非常关键。可通过流动细胞计数，表面等离激元，蛋白质含量测定、扫描电子显微镜及荧光显微镜检查等方法进行测定，这些方法可以单独或联合使用。

3.2 识别特性及特异靶向性评价

偶联后纳米粒上单抗活性的保持对于实现纳米粒的靶向功能至关重要，可以用ELISA法检测免疫纳米粒中单抗的活性，利用间接免疫荧光法观察免疫纳米粒与细胞的特异性反应，考察其对细胞的识别力和亲和力。对于免疫纳米粒的特异靶向性，可以通过荧光标记及电镜检视来观察其在共培养细胞中对特定细胞的特异性靶向来确定和评价，同时与未偶联纳米粒的散乱靶向作对比。

3.3 粒径和聚分散性评价

纳米粒的粒径影响药物的释放、组织分布及从器官中的清除，是一个非常重要的参数。纳米载体系统在80～200 nm时因为EPR效应能显著蓄积在肿瘤组织中并能阻止被网状内皮系统快速的清除，窄的粒径分布确保了纳米粒的均一性和稳定性。纳米粒的粒径大小能影响单抗的结构和活性，粒径较大的纳米粒与单抗接触的有效表面积较大，使单抗变性的可能性就增大;粒径较小的纳米粒与单抗接触的表面积较小，与单抗相互作用的配基较少，使单抗变性的可能性就小。从活性方面考虑，较大纳米粒立体上阻止单抗到达结合位点或是活性部位的能力要强于较小纳米粒，同时较大纳米粒更难保持溶解状态，所以单抗与纳米粒偶联后要控制纳米粒粒径增加的尺度，以免导致溶解度减小［24］。Cirstoiu-Hapca等［25］通过SEM测得抗HER2紫杉醇免疫纳米粒的平均粒径是(148±28)nm，未偶联单抗的纳米粒平均粒径是(132±21)nm，粒径没有显著改变且确保了均一性分布。

3.4 Zeta电位测定

纳米粒表面电荷由于静电力的存在影响悬浮液的稳定性，也能影响和细胞的相互作用，因此免疫纳米粒的构建不能显著影响表面电荷。Cirstoiu-Hapca等［25］测定了抗HER2紫杉醇免疫纳米粒的Zeta电位是(0.2±0.1)mV，未偶联单抗时Zeta电位是(－1.3±0.4)mV，可见单抗的偶联并没有显著改变纳米粒的表面电荷，确保了免疫纳米粒的稳定。

4 结语

如何提高单抗免疫纳米粒的活性、稳定性、组织靶向性，如何增加靶部位有效药物浓度等是目前亟待解决的问题。这些问题可以通过提高单抗的纯度和特异性，合理设计单抗与纳米粒的偶联方式、纯化步骤等来改进。此外还需采用可靠灵敏的分析技术来检验和评价。虽然临床上还没有单抗免疫纳米粒的药品问世，相信随着生物技术、新载体材料以及药物新剂型的发展，在不久的将来一定会开发出高效、安全、使用方便的单抗免疫纳米粒新剂型，从而在诊断和治疗学方面开辟一条新的道路。

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The research progress of monoclonal antibody immuno-nanoparticles

HAO Lei-lei，ZHANG Dian-rui
(School of Pharmaceutical Science，Shandong University，Jinan 250012，China)

R944.9

A

1005-1678(2012)02-0195-04

2011-02-20

郝蕾蕾，女，硕士研究生，Tel:0531-88380293;张典瑞，通信作者，教授，博士生导师，Tel:0531-88382015，E-mail:zhangdianrui2006@163.com。