白喉毒素突变体CRM197原核表达载体构建及其蛋白表达

肖钾钙镁，王素英，魏文进，张静飞，林福玉

（1.北京民海生物科技有限公司研发中心 结合疫苗北京市重点实验室，北京 102600；

2.天津商业大学 生物技术与食品科学学院，天津 300134）

白喉毒素突变体CRM197原核表达载体构建及其蛋白表达

肖钾钙镁1，2，王素英2，魏文进1，张静飞1，林福玉1

（1.北京民海生物科技有限公司研发中心 结合疫苗北京市重点实验室，北京 102600；

2.天津商业大学 生物技术与食品科学学院，天津 300134）

将合成的CRM197基因片段克隆到表达载体pBAD－DEST49中，转化到大肠杆菌菌株（ATCCMC1061）.经阿拉伯糖诱导，CRM197获得高效表达.目的蛋白主要以包涵体形式存在，变性、复性后经DEAE阴离子交换后获得高于95%纯度的CRM197样品.用该样品做Western blotting鉴定后，能得到单一的特异性条带.本实验的表达策略，为CRM197进一步生产及应用奠定基础.

CRM197；白喉毒素；大肠杆菌

白喉毒素（Diphtheria Toxin，DT）是由感染β噬菌体基因组的白喉棒状杆菌所产生的外毒素.白喉毒素经过甲醛脱毒处理后可以制成白喉类毒素，用作疫苗载体蛋白，但要获得白喉类毒素必须经过大体积毒性物质处理，这一处理过程可能恢复白喉毒素的毒性.使用无毒的白喉毒素突变体可以避免上述问题［1－2］.

目前用的最多的是白喉变异毒素CRM197（cross reacting material 197，CRM197）［3］.CRM197是白喉毒素的一种突变体，由白喉毒素的编码基因发生G→A单碱基突变，导致编码产物的第52位氨基酸残基由谷氨酸残基取代了甘氨酸残基，致使白喉毒素酶活性位点发生改变，丧失其酶活性后制得，它已不能对细胞产生毒性作用.但CRM197仍保留了白喉毒素的免疫原性，在抗原性和免疫原性上与天然的白喉毒素相似.CRM197作为载体已成功地用于b型流感嗜血杆菌，肺炎链球菌，脑膜炎双球菌结合疫苗，在动物及人体上均显示出良好的安全性和免疫原性.

该研究采用大肠杆菌表达系统表达CRM197蛋白，进而建立一种廉价、高效、安全的CRM197表达体系.

1 材料与方法

1.1 材料

大肠杆菌菌株（ATCC－MC1061）和载体pBAD－DEST49均为北京民海生物科技有限公司实验室保存.

DNA相对分子质量标准和各种限制性内切酶均购自TAKARA；T4DNA连接酶购自NEB；胶回收试剂盒和质粒小量提取试剂盒均购自中科瑞泰；蛋白质Marker购自北京全式金生物技术有限公司；Sepharose Fast Flow购自GE Healthcare；HRP标记的兔抗马IgG购自北京博奥森生物有限公司；白喉絮状反应抗毒素国家标准品（400Lf）由北京民海生物科技有限公司实验室提供，批号20100201.CRM197阳性对照（28mg／mL）.

1.2 实验方法

1.2.1 目的基因的设计和合成

根据GenBank中白喉毒素的基因序列（登录号：CQ967258），进行密码子优化.合成基因：将其中第155位核苷酸由g变为a.然后在合成基因的5’端加入BglⅡ酶切位点，并在位点后添加信号肽OMPA基因序列［4－5］，3’端应用终止密码子taa并在其后加入XhoⅠ酶切位点.合成实验由上海捷瑞生物工程有限公司完成.

1.2.2 重组质粒的构建

BglⅡ／XhoⅠ双酶切合成的CRM197基因片段，与经过同样酶处理的pBAD－DEST49载体连接，筛选克隆鉴定获得表达载体pBAD－DEST49／CRM197.筛选阳性克隆.进行酶切鉴定.

1.2.3 CRM197的诱导表达

将pBAD－DEST49／CRM197转入大肠杆菌表达宿主中，挑取转化子过夜培养，然后按1∶100（质量分数）的比例转接于质量分数0.1%氨苄青霉素抗性的LB培养基中，37℃、180r／min摇床培养至OD600为0.6时，按1∶100（质量比数）的比例加入终浓度为质量分数20%的阿拉伯糖诱导表达5h.将培养液10 000r／min离心，分离上清和沉淀.沉淀超声破碎后，离心分别收集上清和沉淀.SDS－PAGE检测表达蛋白是以可溶性还是以包涵体形式存在［6－7］.

1.2.4 CRM197的纯化

对以可溶性形式表达的目的蛋白纯化时，收集离心后的上清，过DEAE阴离子柱，用梯度洗脱法洗脱，纯化目的蛋白.对以包涵体形式表达目的蛋白纯化时，收集离心后的沉淀，用8mol／L尿素的裂解液溶解，然后用TE复性，超滤浓缩后过DEAE阴离子柱，纯化目的蛋白［8－9］.

1.2.5 CRM197的鉴定

将纯化后的CRM197和阳性对照样品经SDSPAGE后，用电转仪转移至PVDF膜，以白喉抗毒素（马血清）为一抗，HRP标记的兔抗马IgG为二抗，进行 Western blotting检测.

2 结果与分析

2.1 pBAD－DEST49／CRM197质粒的鉴定

将重组表达质粒pBAD－DEST49／CRM197，经BglⅡ／XhoⅠ双酶切鉴定后，用质量分数0.8%的琼脂糖电泳显示，该重组质粒酶切后产生一条约为1 700bp的条带（见图1），与设计后的CRM197基因片段大小一致.

图1 重组表达载体pBAD－DEST49／CRM197酶切鉴定分析Fig.1 Identification of pBAD－DEST49／CRM197recombinant plasim

2.2 CRM197的表达

经SDS－PAGE分析，菌体上清中无目标蛋白，而离心后的菌体中有大量诱导蛋白.故重组CRM197主要以包涵体的形式表达，表达蛋白的相对分子质量约为6.0×104（生物学常表示为60kD，下同），见图2.

2.3 CRM197的纯化及鉴定

纯化产物经SDS－PAGE及凝胶扫描分析，纯度达95%以上.Western blotting检测结果显示，在相对分子质量为6.0×104处产生一条特异性条带（见图3）.

3 讨论

目前，国外已经成功研制了利用无毒的CRM197作为载体制备小儿肺炎疫苗.但是，由于CRM197的产量比白喉毒素低得多，所以严重制约了疫苗的制备.

图2 表达蛋白的SDS－PAGE分析Fig.2 Expression of recombinant protein analyzed by SDS－PAGE

图3 纯化产物的SDS－PAGE与 Western blotting分析Fig.3 SDS－PAGE results and Western blot analysis of purified CRM197

因大肠杆菌具有遗传性状了解透彻﹑生长快﹑培养经济﹑表达水平高﹑待选质粒和宿主多等特点，在基因工程技术领域已成为首选的表达系统［10］.该研究利用基因重组技术，在大肠杆菌中表达蛋白CRM197.外源蛋白在宿主菌，如大肠杆菌中的表达形式多为细胞内不溶性表达（包涵体），少数为细胞外分泌表达.利用信号肽来引导外源蛋白定位分泌到细胞特定区间，提高可溶性，可避免因包涵体复性带来的困难.目前研究采用的信号肽来自表达系统自身的信号序列或外源信号序列，或两者兼而有之.研究表明，多种外源基因连接上信号肽后，在原核表达系统，如大肠杆菌、L型细菌、芽孢杆菌和乳酸杆菌中等都得到了分泌表达.故该实验室在构建CRM197时，在其5’端连接了具有高分泌功能的分泌型信号肽OMPA.但由于CRM197蛋白太大，相对分子质量约为6.0×104，所以重组蛋白部分分泌到细胞间隙中，其余的主要以包涵体的形式表达.在对包涵体经过一系列变性复性后，过阴离子柱纯化，能获得达到95%以上纯度的蛋白.以后的研究需要加强分泌表达的量和分泌蛋白的纯化工作，还要对包涵体复性的方法进行比较和优化.

利用该研究的表达体系进行大规模工业化生产，能解决CRM197产量不足的问题，促进以它为载体的疫苗研究和生产.

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Expression of diphtheria toxin mutantCRM197by construction of prokaryotic vector in Escherichia coli

XIAOJia－gai－mei1，2，WANGSu－ying2，WEIWen－jin1，ZHANGJing－fei1，LINFu－yu1
（1.Beijing Key Laboratory of Conjugate Vaccine，Beijing Minhai Biological Science and Technology Co.Ltd，Beijing 102600，China；
2.College of Biotechnology and Food Science，Tianjin University of Commerce，Tianjin 300134，China）

The gene ofCRM197（cross reacting material 197，CRM197）is synthesized and then expressed in Escherichia coli（ATCCMC1061）driven by pBAD－DEST49.CRM197is efficiently expressed by Arabinose induced.The recombinant protein is expressed mainly as inclusion body.After denaturation，renaturation and purification by DEAE anion－exchange column，CRM197with the purity higher than 95%is obtained.For Western blotting，the protein can get single specific bands.Given these characteristics，the CRM197expressed in Escherichia coli is suitable for further research.

CRM197；diphtheria toxin；Escherichia coli

Q786

A

1671－1114（2012）03－0078－03

2012－02－03

肖钾钙镁（1984—），女，硕士.

林福玉（1972—），男，副研究员，主要从事基因工程方面的研究.

（责任编校 纪翠荣）