不同剂量尼古丁对成年大鼠阴茎海绵体内源性CO含量及NOS活性影响的研究

徐 辉，于 满，王志勇，辛立升,王振潮,马英慧

(承德医学院附属医院：1.泌尿外科；2.眼科，河北承德 067000)

阴茎勃起是一种神经血管反应过程。勃起功能障碍(erectile dysfunction,ED)是男子最常见的性功能障碍，其发病率占中老年男性的50%，中国约有一亿多男性患有ED，严重影响夫妻生活质量[1]。近10余年来，对于复杂的阴茎勃起机制，研究的重点已由血流动力学移向神经介质方面。研究表明，一氧化氮合酶(NOS)催化L-精氨酸生成的一氧化氮(NO)是介导阴茎勃起的最主要的非胆碱能非肾上腺能(NANC)神经递质，在阴茎勃起过程中起着决定性作用[2]。研究证实，内源性一氧化碳(CO)是一种新型的神经递质[3]，是阴茎勃起的一种基本递质，参与阴茎勃起过程[4]。吸烟是公认的ED的危险因素。尼古丁是香烟烟雾中含量最高的一种成分，本实验通过制备成年雄性大鼠尼古丁给药动物模型，观察大鼠阴茎勃起情况，检测阴茎海绵体CO含量及NOS活性，分析不同剂量尼古丁对其影响，进而探讨吸烟对勃起功能的影响及ED发生的生理机制，为临床上性功能障碍的治疗提供实验依据，现报道如下。

1 材料与方法

1．1材料

1．1．1动物 成年12周龄雄性Wistar大鼠32只。

1．1．2试剂及药物 考马斯亮兰蛋白测定试剂盒(武汉博士德生物工程有限公司)，NOS测定试剂盒(武汉博士德生物工程有限公司)，尼古丁(Sigma公司)，连二亚硫酸钠(还原剂)(南京建成生物工程研究所)，KH2PO4(南京建成生物工程研究所)，阿扑吗啡(APO，Sigma公司)。

表1 各组大鼠阴茎勃起次数及海绵体内源性CO浓度及NOS活性比较±s,n=8)

1．2方法

1．2．1动物分组 选取纯系12周龄雄性Wistar大鼠32只，随机分成4组，每组各8只，分别为对照组、尼古丁(0.5 mg·kg-1·d-1)组、尼古丁(1.5 mg·kg-1·d-1)组、尼古丁(2.5 mg·kg-1·d-1)组。

1．2．2动物模型的制备 各组动物分笼单独饲养，标准复合饲料喂养。将尼古丁溶于生理盐水中制成注射液。尼古丁组(0.5 mg·kg-1·d-1)每日1次皮下注射尼古丁0.5 mg·kg-1·d-1，尼古丁组(1.5 mg·kg-1·d-1)每日1次皮下注射尼古丁1.5 mg·kg-1·d-1，尼古丁(2.5 mg·kg-1·d-1)组每日1次皮下注射尼古丁2.5 mg·kg-1·d-1。给药容积为0.5 mL/kg，对照组每日1次皮下注射等容积的生理盐水。

1．2．3阴茎勃起功能测定 8周后，选择安静的房间内，将大鼠置于玻璃板上，在每只大鼠颈项部皮下注射阿扑吗啡90 μg/kg体质量，观察30 min，记录阴茎勃起次数。以阴茎头充血及阴茎末端露出为勃起1次

1．2．4动物处理及取材 勃起功能检测后，乙醚(99%)麻醉各组大鼠，颈椎脱臼法处死，切开阴茎包皮仔细分离并剥离出阴茎组织(包括球部及海绵体脚)，迅速置于冰冷的改良Krebs液中，去除龟头(含阴茎软骨)、尿道海绵体及阴茎背侧血管，取阴茎海绵体。

1．2．5组织匀浆的制备 将取出的海绵体组织用4 ℃蒸馏水冲洗后，滤纸吸干，电子天平称质量，用眼科小剪将海绵体组织剪成小块，加入体积总量是海绵体重量9倍的0.86%的冷生理盐水，在冰浴中用电动内切式匀浆机制备成10%的组织匀浆，4 ℃低温离心机内，以10 000 r/min离心20 min，取上清液即为10%的海绵体匀浆。

1．2．6阴茎海绵体匀浆中蛋白含量测定(考马斯亮兰法) 取10%阴茎海绵体匀浆上清液用生理盐水按1∶9稀释成1%组织匀浆，按试剂盒说明操作，测各管吸光度值。将吸光度值代入公式计算蛋白含量。

1．2．7CO浓度的测定 取10%的海绵体匀浆按文献[5]的方法测定CO浓度。

1．2．8NOS活性的测定 取10%的海绵体匀浆按测定试剂盒说明操作，测各管吸光度值。将吸光度变化的差异代入NOS酶活性计算公式算出总NOS活性。

2 结 果

2．1观察大鼠外观 对照组大鼠生长迅速，体质量逐日增加，毛色白，有光泽，活动灵敏，进食正常。尼古丁各组大鼠出现精神不振、食欲减退、体质量减轻、毛色发黄、无光泽、粗糙稀少、对外界刺激反应迟钝、少活动等表现。

2．2阴茎勃起功能测定 尼古丁注射各组大鼠阴茎勃起次数都较对照组降低(P<0.01)。尼古丁给药时间越长，阴茎勃起次数越少。尼古丁注射各组间两两比较，尼古丁(0.5 mg·kg-1·d-1)组与尼古丁(1.5 mg·kg-1·d-1)组比较，差异无统计学意义(P>0.05)；尼古丁(1.5 mg·kg-1·d-1)组与尼古丁(2.5 mg·kg-1·d-1)组比较，差异无统计学意义(P>0.05)，尼古丁(2.5 mg·kg-1·d-1)组与尼古丁(0.5 mg·kg-1·d-1)组比较，差异有统计学意义(P<0.01)，见表1。

2．3NOS活性定量分析 尼古丁注射各组大鼠阴茎海绵体匀浆中NOS活性都较对照组降低，差异有统计学意义(P<0.01)。尼古丁给药时间越长，NOS活性越低。尼古丁注射各组间两两比较，差异有统计学意义(P<0.01)，见表1。

2．4内源性CO浓度测定 尼古丁注射各组大鼠阴茎海绵体匀浆中CO浓度都较对照组降低，差异有统计学意义(P<0.01)。尼古丁给药时间越长，内源性CO含量越低。尼古丁注射各组间两两比较，差异有统计学意义(P<0.01)，见表1。

3 讨 论

阴茎勃起是一个复杂的心理-生理过程，本质是一系列神经-血管活动，是神经-内分泌调控下阴茎海绵体血流动力学变化过程。阴茎勃起和疲软态的血流动力学受海绵体平滑肌舒张和收缩调控。正常阴茎勃起机制决定于海绵体平滑肌收缩与舒张的精确平衡[6]。海绵体平滑肌收缩由交感神经释放去甲肾上腺素激活α-肾上腺能受体所调控，而舒张则由副交感神经释放的乙酰胆碱和神经递质NO介导[7]。ED的病因学分为几个主要方面，20年前认为80%的ED是心理性的，但现在广泛承认最常见并可解释大多数病例的原因是血管病变，许多血管疾病的危险因子与ED的危险性有关，包括吸烟，血清总胆固醇浓度。吸烟可促进动脉粥样硬化，引起血管收缩，减少阴茎血流和增加血液黏稠度，同时可增加血液中CO2含量，减少阴茎氧供。因此，吸烟是ED的危险因素，是公认的器质性ED发生的危险因子。尼古丁是香烟烟雾中的一种重要成分，是烟草致病的主要成分之一，属吡啶衍生物类生物碱，是一种难闻、味苦、无色透明的油质液体，挥发性强，在空气中极易氧化成暗灰色，能迅速溶解于水及乙醇中，通过口、鼻、支气管黏膜很容易被机体吸收，有剧毒，少量对中枢神经有兴奋作用，能升高血压，大量则抑制中枢神经系统，使心脏麻痹以致死亡。本实验中参考蓝晓红等[8]皮下注射尼古丁的方法，制备尼古丁给药动物模型，观察成年大鼠阴茎勃起次数，发现尼古丁给药各组大鼠阴茎勃起次数较对照组明显下降，说明尼古丁能导致大鼠ED。观察中发现尼古丁给药剂量越大，阴茎勃起次数越少，尼古丁(2.5 mg·kg-1·d-1)组较尼古丁(0.5 mg·kg-1·d-1)组明显下降，差异有统计学意义(P<0.01)，尼古丁(1.5 mg·kg-1·d-1)组较尼古丁(0.5 mg·kg-1·d-1)组、尼古丁(2.5 mg·kg-1·d-1)组较尼古丁(1.5 mg·kg-1·d-1)组亦减少，但差异无统计学意义(P>0.05)，分析原因可能与本研究设计的剂量梯度不足够大、样本数偏小有关。在实验中观察发现，尼古丁各组大鼠出现精神不振、食欲减退、体质量减轻、毛色发黄、无光泽、粗糙稀少、对外界刺激反应迟钝、少活动等表现，再次证实吸烟的危害。现代医学认为，吸烟对勃起功能的损害是多方面的。主要包括：对血流动力学的影响、对外周神经递质释放的影响、对性激素的影响。已有研究表明吸烟对交感神经的影响是通过尼古丁的作用实现的。NO在体内是通过NOS催化L-精氨酸产生的，NO非常活跃，半衰期仅为数秒钟，很难对其进行精确的研究，而NOS是NO合成过程的限速酶，可作为研究NO的替代，NOS活性降低是导致ED的主要原因[9]。Xie等[10]将成年大鼠(5月龄)和老年大鼠(20月龄)分别暴露在香烟的烟雾中被动吸烟8周，结果成年大鼠和老龄大鼠阴茎组织总NOS活性分别下降73%、62%。国内杜国顺和胡礼泉[11]将4、10、16月龄的Wistar雄性大鼠放于密闭容器内被动吸烟2个月，发现吸烟组大鼠与对照组相比，NOS活性分别下降41%(4月龄)、69%(10月龄)和58%(16月龄)，差异有统计学意义(P<0.05)。然而有关香烟烟雾的主要成分——尼古丁对大鼠阴茎海绵体NO类血管舒张因子影响的研究，目前报道较少。本实验通过检测尼古丁给药各组大鼠阴茎海绵体NOS活性，发现尼古丁给药各组大鼠NOS活性显著下降，与对照组比较差异有统计学意义(P<0.01)，尼古丁剂量越大，NOS活性越低，尼古丁给药各组两两比较差异有统计学意义，说明尼古丁可通过抑制NOS活性，从而致NO合成不足，导致阴茎舒张能力减弱而致ED。

内源性CO是近十几年来研究证实的重要的细胞信使分子之一。研究表明，内源性CO的作用方式类似于NO[12-13]，二者在生理功能上有许多共同点。内源性CO主要由血红素氧合酶(heme oxygenase,HO)催化分解血红素而产生。HO有HO-1、HO-2和HO-3共3种同工酶。研究发现，CO可以减弱大鼠阴茎海绵体的张力，HO的抑制剂能抑制海绵体的舒张效应[14]。研究发现，阴茎海绵体上的HO-2和内皮型NOS参与调节阴茎的勃起[15]。可见，CO/HO在阴茎勃起中起重要作用。本实验通过测定实验各组大鼠阴茎海绵体内源性CO含量，发现尼古丁给药的各组大鼠阴茎海绵体内源性CO含量显著降低，与对照组比较差异有统计学意义(P<0.01)，尼古丁剂量越大，CO含量越低，尼古丁给药各组两两比较差异有统计学意义，说明尼古丁对大鼠勃起功能的影响有内源性CO的参与，从而说明内源性CO是吸烟引起ED的一种新型神经递质，为探讨吸烟致ED的发生机制及临床治疗提供新的途径。有关其确切机制和临床意义的研究极有价值，有待深入研究。

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